Menu
vitalyatattoo.ru — Студия художественной татуировки и пирсинга ArtinMotion Разное Ладонь фото: D0 bb d0 b0 d0 b4 d0 be d0 bd d0 b8 d1 80 d1 83 d0 ba d0 b8 картинки, стоковые фото D0 bb d0 b0 d0 b4 d0 be d0 bd d0 b8 d1 80 d1 83 d0 ba d0 b8

Ладонь фото: D0 bb d0 b0 d0 b4 d0 be d0 bd d0 b8 d1 80 d1 83 d0 ba d0 b8 картинки, стоковые фото D0 bb d0 b0 d0 b4 d0 be d0 bd d0 b8 d1 80 d1 83 d0 ba d0 b8

Содержание

Amazon придумал технологию оплаты сканированием ладони

Amazon в своем блоге представил устройство Amazon One с технологией считывания ладони. Компания называет этот новый способ бесконтактной оплаты и идентификации человека быстрым и удобным.

Для сканирования ладони человек должен поднести ее к устройству и подержать 1-2 секунды. У людей не бывает двух одинаковых ладоней, поэтому технологии компании считывают индивидуальные особенности каждой и по ним определяют человека. Такой способ можно использовать в том числе на проходных, например на стадионы или в офисы, в которые разрешен доступ людям с билетами или пропуском, отмечает Amazon.

С 29 сентября устройства появятся на входе в два фирменных магазина Amazon Go в Сиэтле (там расположена штаб-квартира компании). Регистрация займет меньше минуты: нужно будет вставить банковскую карту в устройство, поднести ладонь, и компьютер свяжет изображение ладони с конкретным счетом. Аккаунт Amazon не требуется. Можно добавить обе ладони или только одну. После этого для доступа в магазин не потребуется приложение Amazon или помощь сотрудника — можно будет пройти, поднеся ладонь. Изображения ладоней не хранятся на устройстве: Amazon обещает, что они будут надежно храниться в облачных сервисах компании. По запросу данные о своей ладони можно будет удалить. Amazon планирует передавать технологию в том числе другим компаниям.

Реклама на Forbes

Как Amazon помогает ученым разработать новейшие способы диагностики коронавируса

Распознавание ладони считается более приватным, чем другие биометрические альтернативы, потому что невозможно определить личность человека по изображению ладони, пишет Amazon. Компания считает, что придуманный ею способ дает клиентам полный контроль над тем, как и когда они используют сервис: ведь для операции потребуется специальный жест — поднести и подержать ладонь над устройством.

Сейчас, помимо привычных способов оплаты наличными или банковской картой, есть еще несколько альтернативных путей: оплата мобильными устройствами (Apple Pay, Google Pay, Samsung Pay), оплата считыванием QR-кода, сканированием лица и т.д. В магазинах Amazon Go нет кассиров: оплата товаров, которые покупает человек, происходит автоматически за счет датчиков движения, камер и умных весов.

Amazon возглавляет Джефф Безос — самый богатый бизнесмен мира по версии Forbes. Его состояние в реальном времени оценивается в $186,9 млрд.

Дом, где Безос создал Amazon, выставили на продажу

5 фото

Как правильно бинтовать руки боксерскими бинтами. Метод профессиональных боксеров.

Научитесь правильно бинтоваться, чтобы увеличить силу удара и предотвратить травмы. Метод, которым пользуются боксеры в зале Фреди Роуча Wildcard Boxing.

 

Зачем вообще бинтовать руки?

Руки – самое главное оружие боксера. Они состоят из множества маленьких костей и сухожилий, которые легко повредить. Боксерские бинты собирают и удерживают вместе ваше запястье, пальцы, костяшки.

Многие люди неправильно думают, что это всего лишь дополнительная защита для костяшек. Это не так, для защиты кулака есть боксерские перчатки. Бинты же, таким образом стягивают руку, чтобы шок возникающий при ударе, причинил как можно меньший ущерб.

Если руки неправильно забинтованы, или боксерские бинты вообще отсутствуют, то велик риск перелома мелких костей запястья. Даже если они не сломаются, то возможны различные воспаления, которые не позволят Вам делать обычную домашнюю работу, печатать на компьютере, держать ручку. В общем поверьте – это очень болезненные и главное, долго заживающие травмы. Сохраните свои руки для жизни после бокса)

  

Как бинтовать руки

Вам понадобится пара боксерских бинтов. Мне нравится длина в 4.5 метра, но можно пользоваться и меньшей длиной.

 

Итак, начнем!

 

1. Накиньте петлю на большой палец и начните бинтовать ПОВЕРХ руки. В дальнейшем всегда придерживайтесь направления ОТ большого пальца.

Так делать НЕ НАДО!

2. Три раза вокруг запястья

Это обеспечивает поддержку кисти. Если у Вас короткие бинты или большие руки, то можете сделать два оборота.

 

3. Затем три раза вокруг ладони

 

Просто оборачиваете ладонь. Не надо залезать на костяшки

В конце вернитесь к основанию большого пальца.

4. Три X через пальцы.

Теперь Вам нужно изобразить X на ладони боксёрским бинтом, который проходит между пальцами. Эта часть намотки позволит костяшкам быть собранными в кулак, в тоже время защищая их от повреждения.

Начинайте с мизинца и безымянного пальца.

Теперь изнутри в сторону большого

Затем спускайтесь вниз до основания кулака. Изнутри запястья выводите под большой палец. Боксерский бинт сформировал своеобразный X.

Затем опять наверх. Между безымянным и средним пальцем

Сформирован второй X.

Обратно наверх. Займемся ложбинкой между средним и указательным пальцами.

Завершаем по нашей технологии третий X. Все пальцы забинтованы правильно!

Мы оказались под большим пальцем.

5. Обматываем большой палец

Разок обматываем вокруг запястья

Оказываемся с наружного ребра ладони

6. Укрепляем большой палец

Пропускаем бинт снаружи и уходим по ладони вниз.

Мотаем именно ладонь. Это позволит нам прикрепить большой палец ко всей конструкции кулака, что минимизирует возможность получения травмы. Заметьте, что бинтование сменило направление на «к большому пальцу».

7. Три раза вокруг костяшек

 

Мотаем бинт по костяшкам.

8. Остался бинт?

Если у Вас остался еще бинт, то можете сделать дополнительный “X”

ИЛИ

Можете мотнуть пару раз по костяшкам.

Заканчиваем на запястье. 

Полезные подсказки при намотке боксерских бинтов

        ·         Вам должно быть комфортно. Рука расслаблена, но когда сжимается в кулак, то бинты натягиваются. Если после 30 минут, Вы чувствуете боль или пальцы побелели, то скорее всего «перетянули» бинты.

·         Туго или Слабо бинтовать запястье. Все зависит от Ваших предпочтений. Лично я люблю, когда запястье хорошо перетянуто. Однако, многим нравится подвижность, для качественного нанесения хуков и апперкотов.

Обязательно защищайте свои руки! А купить боксерские бинты всегда можно у нас! В магазине товаров для бокса Rocky-shop.ru

 

Контрактура Дюпюитрена: симптомы, причины, диагностика

Контрактурой Дюпюитрена называется невоспалительная патология, поражающая сухожилия ладоней. Из-за их укорочения нарушается функционирование всей кисти. У человека возникают трудности при выполнении ранее привычных движений — захвата и удержания рукой предмета, упора на любую поверхность.

Патология имеет тенденцию к медленному прогрессированию в среднем и пожилом возрасте. А у молодых пациентов отмечается значительно более быстрое развитие контрактуры Дюпюитрена, ее распространение на здоровые сухожилия.

Контрактура Дюпюитрена довольно распространена в травматологической и ортопедической практике. Заболеванию подвержены мужчины 35-50 лет, при этом двустороннее поражение выявляется в 50% случаев. У женщин оно диагностируется в 10 раз реже и переносится ими значительно легче. На начальном этапе развития контрактуры Дюпюитрена проводится консервативное лечение. При серьезном повреждении сухожилий пациентам показано хирургическое вмешательство.

Существует 3 стадии контрактуры Дюпюитрена:


Причины, механизм развития патологии

В ладонных сухожилиях образуются участки неэластичных, плотных фиброзных тканей. Так как они лишены какой-либо функциональной активности, то нарушается работа всей кисти. Если больной не обращается за медицинской помощью при первых признаках патологии, то соединительнотканные тяжи укорачиваются. Возникает тугоподвижность одного или нескольких пальцев. Ситуация усугубляется появлением сгибательной контрактуры, ограничивающей объем пассивных движений.

Причины развития заболевания не установлены. Ранее выдвигались версии, что поражение сухожилий может быть спровоцировано сахарным диабетом, нарушениями обмена веществ, но пока они ничем не подтверждены.

Существуют предположения и о таких причинах невоспалительного поражения сухожилий:

  • предшествующие травмы — переломы, вывихи, разрывы мышц, связок, сухожилий;

  • наследственная особенность строения широкой сухожильной пластинки, сформированной из плотных коллагеновых и эластических волокон;

  • поражение периферических нервов.

Симптомы и признаки заболевания

Клиническая картина контрактуры Дюпюитрена весьма специфична. Сначала на ладони формируется небольшое округлое уплотнение, состоящее из одного или нескольких подкожных тяжей. Постепенно оно увеличивается в размере, ограничивая подвижность пальца. Затем появляются тяжи, которые отходят к фалангам. Сухожилие медленно укорачивается, провоцируя образование контрактуры в пястно-фаланговом суставе. Вскоре палец перестает полноценно сгибаться и в проксимальном межфаланговом суставе.

Кожа около узла уплотняется, огрубевает, начинает спаиваться с рядом расположенными мягкими тканями. На участке поражения появляются бугорки, небольшие углубления.  При разгибании ткани тяжи хорошо просматриваются на поверхности ладони. Контрактура Дюпюитрена проявляется болями только у 10% пациентов. Они локализованы не четко, а распространяются на всю руку, иногда отдают в плечо.


К кому обращаться за лечением

Если один или сразу несколько пальцев стали сгибаться с трудом, то нужно записаться на прием к травматологу или ортопеду. Не станет ошибкой и обращение к врачу общего профиля — терапевту. Он осмотрит пациента, проведет ряд функциональных тестов. После их изучения пациент будет направлен к врачам более узкой специализации.

Последствия и осложнения

Если патологический процесс протекает в тяжелой форме, то тыльная поверхность проксимальных межфаланговых суставов видоизменяется. На ней формируются плотные узелковые наросты. Отмечены случаи образования бугров в области лучезапястного сустава. При отсутствии врачебного вмешательства возникают стойкие сгибательные контрактуры пальцев. Человек утрачивает способность выполнять профессиональные обязанности, обслуживать себя в быту.

Диагностика контрактуры Дюпюитрена

При контрактуре Дюпюитрена крайне важна ранняя диагностика, поскольку лечение на ранних этапах позволяет замедлить развитие болезни, что даёт возможность пациенту продолжать трудовую деятельность. В её основе лежит визуальная оценка кистей пациента (оценивается пассивное положение пальцев кистей, участки омозоленности, бугорки на коже), их пальпация (определение подкожных узелков и их размеров, деформации суставов, уплотнения апоневроза) и оценка нарушений двигательных функций кисти (максимальное разгибание пальцев, хватания и удержания предметов, скорость уставания кисти).

Немаловажными являются и инструментальные методы диагностики:

  • Рентгенография кисти, которая позволяет судить о степени поражения суставов.

  • Биопсия перерожденного апоневроза, применяется для дифференциальной диагностики.

  • Реовазография, позволяет уточнить границы дистрофически измененных тканей.

  • Компьютерная томография, при решении вопроса об оперативном лечении.

Дифференциальную диагностику приходится проводить с заболеваниями со схожей симптоматикой и начальными проявлениями, например, ревматоидный артрит, ишемическая контрактура, склеродермия, тендовагинит, новообразования соединительной ткани.

Наши специалисты

Детский ортопед

Стаж: 17 лет

Записаться на приём

Ортопед, травматолог

Стаж: 27 лет

Записаться на приём

Лечение заболевания «Контрактура Дюпюитрена» в нашем центре

groupНоменклатураНоменклатураЦенаЦена

Запишитесь на прием

Болезнь де Кервена. Симптомы, лечение.

Одно из заболеваний, которое нарушает качество жизни и приводит к нетрудоспособности, является Болезнь де Кервена – отдельная форма хронического тендовагинита, сопровождается воспалением сухожилия большого пальца.

Почему возникает тендовагинит де Кервена.

Единственная причина болезни – перегрузка кисти. Сухожилия мышцы-разгибателя и отводящей мышцы большого пальца проходят в одном очень узком канале. При воспалении сухожилия утолщаются и суживают канал, раздражая болевые рецепторы. Усугубляет ситуацию и то, что эти мышцы являются синергистами, то есть выполняют одинаковые функции. Поэтому любое движение большого пальца становится крайне болезненным.

К стенозирующему тендовагиниту склонны определенные категории людей:

  1. Принадлежащие к следующим профессиям: пианисты, слесари, маляры, швеи, доярки. Воспаление случается и у работников других сфер, где нужно выполнять однотипные движения кистью.
  2. Домохозяйки и молодые мамы. Воспаление сухожилия связано с работой по дому (ручная стирка, мытье посуды) и постоянным ношением младенца на руках.
  3. В последние годы стенозирующему тендовагиниту подвержены люди, постоянно листающие соцсети на смартфоне. У работающих за компьютером тоже есть риск воспаления сухожильных оболочек.

Также болезнь де Кервена – прямое последствие одной крупной травмы кисти или повторяющихся мелких травматизаций. Например, у игроков в теннис или бадминтон нередко возникают жалобы на боли в запястье, связанные с сильными ударами спортивных снарядов о ракетку.

Симптомы заболевания

Основным симптомом болезни является ноющая боль в основании большого пальца, в запястье и предплечье, особенно после длительной нагрузки. Начинается постепенно, может развиваться несколько недель.

При прогрессировании заболевания, боль становится постоянной, любое движение пальцем или кистью становится практически невыполнимым. Характер болей: резкий, внезапный или же ноющий, боль может не проходят даже в состоянии покоя.

Иногда появляется болезненная припухлость большого пальца руки, еще реже – киста с жидкостью на запястье.

Диагностика

При первых болевых симптомах необходима консультация врача-ортопеда. Врач осмотрит руку пациента, пропальпирует (прощупает) пораженную область и при необходимости назначит дополнительные исследования. Для подтверждения болезни де Кервена назначается рентгенологическое и ультразвуковое исследование.

Тест Финкельштейна

Характерный признак стенозирующего тендовагинита – сильная и резкая боль в основании большого пальца при выполнении теста Финкельштейна.

Суть пробы Финкельштейна: согнув большой палец к ладони, положить остальные пальцы на него сверху, а затем отвести всю кисть в сторону мизинца. Если при этом происходит усиление боли, то тест считается положительным.

 

 

Еще один способ определить синдром де Кервена – взять большими и указательными пальцами обеих рук два одинаковых предмета (карандаши, зажигалки). Затем другой человек легонько тянет эти предметы одновременно на себя. В больной руке должны появиться слабость, неприятные или даже простреливающие ощущения.

Консервативное лечение

Лечение болезни де Кервена должно быть комплексным. Основная цель консервативной терапии – борьба с воспалением сухожилия и снятие болевого синдрома. Для этого применяются:

  • Обезболивающие: нестероидные противовоспалительные препараты в таблетках (Диклофенак, Кетопрофен, Парацетамол и т.п.). При невыносимых болях врач прописывает инъекции Гидрокортизона/Новокаина в основание большого пальца.
  • Местная терапия: Гепариновая мазь, Диклак, Долгит-крем (мази втираются массажными движениями).
  • Обездвиживание: иммобилизирующие гипсовые повязки, пластиковые шины или современные аналоги – кинезиотейпы для обеспечения покоя воспаленным сухожилиям. Иммобилизация продолжается до двух недель.
  • Физиотерапия (фонофорез с Гидрокортизоном, магнитотерапия, прогревание озокеритом или парафином).
  • В незапущенных случаях помогают массажи и теплые ванночки для рук.

Оперативное лечение

Если консервативной терапии недостаточно, например, постоянно возникают рецидивы заболевания, врачи рекомендуют перейти к оперативному лечению. Операция проводится под местным обезболиванием.

Во время вмешательства хирург:

  • Получает доступ к каналу связки большого пальца.
  • Удаляет ткани, которые воспалились.
  • Разрезает сросшиеся сухожилия (спайки).
  • Убедившись, что связка двигается свободно, ушивает рану.

Операции бывают открытые и малоинвазивные, но суть у них общая – снять компрессию (сдавливание) сухожилия. При открытом вмешательстве кожа над воспаленной областью разрезается, и врач видит ситуацию целиком. Однако после открытого вмешательства остается большой зигзагообразный или продолговатый шрам, восстановительный период длится дольше.

Малоинвазивная операция (закрытым способом) оставляет мало следов – всего несколько проколов на коже. Малотравматичный метод проведения операции позволяет сократить восстановительный период работоспособности кисти, что положительно сказывается на состоянии здоровья пациента.

В обоих случаях после операций рецидивы бывают крайне редко. Хирургический метод лечения считается более эффективным, чем консервативный.

В восстановительный период после операции нужно выполнять упражнения, которые порекомендует специалист ЛФК. Первые несколько дней или недель, пока не восстановятся нервные волокна, возможно ощущение «мурашек» и низкая чувствительность кисти.


Определяем болезни по рукам: если ладони красные — барахлит печень, мокрые — проблемы с гормонами

27 мая 2010 14:34

Руки человека не хуже анализов покажут, что в организме не так

Оказывается, по рукам можно не только предсказывать прошлое и будущее. Но и определять болячки, сообщает газета «Версия». Россияне охотно изучают теперь свои руки! И активно копируют статью в свои блоги. Так, что рассказ про руки попал в хитпарад Рунета. «Красные ладони свидетельствуют о токсическом поражении печени: возможен гепатит или гепатоз. Мраморный рисунок на ладонях говорит о неполадках в вегетативной нервной системе. Если кожа ладоней приобретает желтоватый оттенок, то наверняка есть изменения в печени или желчном пузыре (гепатит, желчнокаменная болезнь, нарушения в желчных путях, холангит, холецистит). Коричневые пятна с тыльной стороны кисти говорят не только о возрасте (нарушения в пигментной окраске кожи, характерные в основном для пожилых людей), но и означают, что у вас есть проблемы с желчным пузырем. Если кожа на кисти, и особенно на ладони, шелушится мелкими пластинками, это может быть верным свидетельством недостатка витаминов А и D. Если же ладони шелушатся крупными пластинками, необходимо обратиться к дерматологу: на руках поселился грибок. Температура рук — барометр состояния Холодные руки — признак нарушения периферического кровообращения, организму недостает никотиновой кислоты. Следовательно, нужно позаботиться о том, чтобы пополнить ее запас с помощью витаминных препаратов или добавить в рацион продукты, содержащие эту кислоту в достатке: молочные продукты, мясо, рыбу, грибы, гречку, фасоль, капусту. Если ладони, наоборот, горят, значит, печень не справляется с интоксикацией, вызванной отравлением лекарством, алкоголем, химическими веществами. Врачи называют их печеночными. Синдром «ползания мурашек» по ладони говорит о том, что у человека проблемы с эндокринной системой. Влажные руки также указывают на эндокринные неполадки — возможно, на гиперфункцию щитовидной железы. А сухость и бледность кожи на ладонях — на гипофункцию щитовидки (гипотиреоз). Пятна на кончиках пальцев могут свидетельствовать о проблемах со здоровьем Если у человека часто немеют мизинцы, ему следует обратиться к кардиологу — эти проблемы связаны с сердечно-сосудистой системой. А онемение больших пальцев свидетельствует о слабости дыхательной системы. Если на коже концевых фаланг пальцев появились глубокие продольные складки, похожие на морщины, следует обратить внимание на эндокринную систему — возможно, у вас гипотиреоз либо сахарный диабет. Если кончики пальцев приобрели пурпурный цвет, надо заняться пищеварительной системой. Темно-красный или даже лиловый — следует обратить внимание на почки и печень. Пятна на буграх Венеры (так хироманты называют возвышенные основания больших пальцев) — возможный признак того, что не все в порядке с половыми органами. Зуд боковой поверхности указательного пальца правой руки свидетельствует о проблемах, возникших в работе толстой кишки. Шероховатость кожи на тыльной поверхности указательного пальца нередко указывает на неполадки с желчным пузырем. Хруст в суставах — признак дефицита кальция Немало интересных выводов можно сделать, обратив внимание на состояние суставов. Чересчур гибкие суставы (как и, наоборот, совсем не сгибающиеся) при общем сниженном тонусе мышц пальцев означают неполадки в работе печени и желчного пузыря. Хруст в суставах кистей указывает на недостаток кальция в организме. Неправильной формы болезненные суставы пальцев — признак артроза. Чаще всего такие изменения возникают у людей, страдающих подагрой. Если суставы начали болезненно опухать и отекать, появилась краснота, нужно срочно обратиться к врачу — это явное проявление полиартрита. А боль между второй и третьей фалангами безымянного и указательного пальца предупреждает о скором проявлении серьезного недуга в коленных суставах. По форме руки можно вычислить будущие недуги Издавна замечено: чем шире ладонь, тем крепче здоровье. Однако люди с широкими ладонями и короткими пальцами склонны к нарушениям в системе кровообращения, прежде всего к повышению кровяного давления. Узкие ладони с тонкими длинными пальцами и бледной кожей обычно бывают у людей с тонкой нервной организацией, чутко реагирующих на резкие перепады температуры или атмосферного давления, смену часовых поясов, резкие звуки, эмоциональные перегрузки. У обладателей маленьких кистей слишком восприимчивая вегетативная нервная система: их «фирменные» заболевания — бронхиальная астма, воспаление прямой кишки, гипотония. Люди с мясистыми ладонями чаще всего имеют проблемы с кровообращением: у них снижен обмен веществ, возможна гипофункция щитовидной железы. Точка боли указывает на неполадки в конкретном органе Согласно китайской медицине, точка в самом центре ладони считается энергетическим центром всего организма. Если, резко нажимая на нее большим пальцем другой руки, ощущается пронзительная боль – это означает наличие серьезных проблем со здоровьем и указывает на необходимость всерьез заняться своим самочувствием. Болезненность, появляющаяся при сжатии большим пальцем одной руки места у основания большого пальца другой с тыльной стороны кисти, а указательным — со стороны ладони, говорит о неполадках в сердце: скорее всего, это начало ишемической болезни. На патологию в мочеполовой системе укажет сильная болезненность при сжатии бугорка между средним и безымянным пальцами. Если провести воображаемую линию от точки между мизинцем и безымянным пальцем к запястью, то нижняя треть этой линии на ладони (от запястья) соответствует зоне печени и желчного пузыря: боль, появившаяся здесь при нажатии, означает, что есть нарушения в работе этих органов. Все вышеперечисленное свидетельствует лишь о возможных неполадках в вашем организме, и абсолютного значения такой «рукотворной» диагностике придавать не стоит — она лишь повод обратиться к врачу, и заняться своим здоровьем.»

Весна истории

Вождь мирового пролетариата, неспешно шагающий сквозь время, на самом деле призывает весну. Монумент дедушки всех революций укрылся в елях и вовсе не стремится украшать село Раевский. Он не выглядит как туристская достопримечательность, но является ею по праву и по сути. Во-первых, в этом памятнике Ленину куда больше исторической правды и обоснований, чем у десятков тысяч подобных по всему миру. А ведь их до сих пор только в России в наличии больше девяти тысяч — живее всех живых.

Владимир Ильич действительно побывал в Раевке, на вокзале, и неподалеку, на хуторе кочевников возле деревни Альшеево, в июльский день 1900-го. Он приехал на встречу со сгинувшим потом накануне Первой мировой войны молоденьким воронежским социал-демократом Владимиром Носковым. И не было тогда еще Ленина, а был Владимир Ульянов, и не существовало еще знаменитой впоследствии газеты «Искра». Двое молодых, полных надежд человека и не помышляли о социалистической революции.

Во-вторых, раевский Ленин художественно уникален — подобных, прямо сказать, не более десятка на планете. Не счесть памятников, где Ильич, воздев руку, куда-нибудь ведет, указывает на что-то. Самый знаменитый — работа Кербеля на Калужской площади в Москве, реплики с которого разбрелись по десяткам городов. Спишем на дозволенную фантазию скульпторов революции различные вариации с указующей рукой Ленина — то правой, реже — левой, то с раскрытой ладонью, то с вытянутым пальцем. Бывает, что Ленин куда-то идет, но чаще всего статичен, поза задумчивая — опять-таки, материала на такой памятник требуется меньше, а поза поддается ваянию легче, естественнее, чем капризная динамика. Гораздо больше памятников изображают Ленина безо всяких указующих жестов, руки опущены, а то и вовсе спрятаны в карман. Вероятно, потому, что так скульптура получается устойчивее и дешевле. Прагматично, не более того.

Альшеевский Ленин словно делает первый шаг в народном танце, рука необычно отведена в сторону и открытая ладонь смотрит в небо. Это скорее классическая поза, в которых греки и латиняне запечатлевали мыслителей, философов и общественных деятелей, тут уместнее тога и книга в левой руке. Набросивший роскошный меховой воротник и кокетливую феску из последнего снега, Ленин в селе Раевский будто обдумывает апрельские тезисы, но не канонические строки революционной программы, а оды пробуждения природы. Молчит, ловит ладонью лучи солнца, призывает весну.

Альшеевский район.

форма ладони расскажет о вашем характере

Вам понравился человек и хочется узнать получше? А может вам интересно узнать чуть больше о себе?

Хиромантия – наука, позволяющая сказать о человеке лишь по его ладоням. Зная некоторые моменты теории этой науки, можно предположить о том, что за человек перед вами.

Иллюстрация Colady от Кирилла Даниленко  Загрузка …

Хироманты выделяют 4 основных типа ладони:

  1. Ладонь напоминает квадрат, а пальцы короткие.
  2. Длинные пальцы с ладонью слегка вытянутого квадрата.
  3. Ладонь немного вытянута, пальцы короткие.
  4. Ладонь вытянута сильно, пальцы тоже длинные.

Эксперты утверждают, что можно сделать предположения о характере человека, посмотрев на форму ладони и длину пальцев.

Определяем характер по форме пальцев

Первый тип – обладатели данной формы руки придерживаются консервативных взглядов, они практичны и их желания более просты и «реальны».

Здесь присутствует и достаточно гибкий интеллект. Такие люди с лёгкостью адаптируются к любым ситуациям, но с большим трудом им удаётся держать свои эмоции под контролем.

Второй тип – такие люди достаточно эмоциональны, импульсивны и могут быть вспыльчивы, но контролировать это у них получается лучше, чем людям с первым типом ладоней. Люди со вторым типом творческие и любят самоутверждаться.

Это может происходить за счёт других людей, и это является основным минусом. А в целом окружающие знают, что вы отзывчивый, добрый и всегда придёте на помощь.

Третий тип – эти люди достаточно энергичны, они могут стучать пальцами по столу, трясти ногой оттого, что энергию нужно куда-то девать, что-то делать. Способности организатора на хорошем уровне.

Врождённый навык манипуляции людьми, но нельзя забывать – что другие люди не куклы, и у них тоже есть чувства.

Четвёртый тип – люди с четвёртым типом беспокойны, тревожны, не уверены в себе, но внутри кроется доброта, которую они готовы дарить всем бескорыстно.

Если у вас четвёртый тип ладони, то вы достаточно мягки и чувствительны, возможно, ранимы и сентиментальны. В некоторых моментах преобладает интуиция над логикой, которая достаточно хорошо развита. У вас большое чувство к прекрасному и творческие способности не хуже, чем у людей со вторым типом.

Также рекомендуем вам пройти ещё один интересный тест: Линия сердца на правой ладони многое расскажет о вас

 

 

Palm* Photo Prize 2022

  • Аластер МакКимм – главный редактор i-D

Смелая и современная эстетика Аластера МакКимма позволяет ему реконструировать моду в любом контексте. Родившийся и выросший в Северной Ирландии, МакКим начал свою карьеру стилиста в Лондоне после изучения дизайна одежды в Ноттингемской художественной школе. Талант МакКимма создавать чистые и четкие образы привлек внимание таких дизайнеров, как Saint Laurent, Anthony Vaccarello, Calvin Klein, Jil Sander, The Row, Alexander Wang и Versus Versace, которые приглашают его для своих кампаний, консультаций и показов мод.Кроме того, его редакционное сотрудничество осуществляется с известными фотографами, такими как Крейг МакДин, Дэвид Симс, Марио Сорренти, Вилли Вандерперре, Инес и Винуд, Микаэль Янссон, Дэн Джексон, Эми Трост и Паоло Роверси. МакКимм — главный редактор i-D. До своего назначения в i-D он регулярно писал для T, The New York Times Magazine, British Vogue, Vogue Italia и Self Service.

  • Джемма Флетчер — писатель, фоторедактор, подкастер

Джем Флетчер — это гибридный творческий проект, ориентированный на визуальную культуру на стыке жизни и искусства.Благодаря исследованиям в кино, фотографии, звуке и языке она создает истории, которые вызывают эмоции и бросают вызов точкам зрения. Помимо своей личной исследовательской практики, она работает в различных контекстах, включая редакционное, коммерческое и изобразительное искусство. В 2019 году Gem запустила подкаст The Messy Truth , серию откровенных бесед, раскрывающих будущее визуальной культуры и то, что значит быть фотографом сегодня.

Джем — независимый писатель, специализирующийся на фотографии, искусстве и творческом процессе, а также на том, как они проявляются в современной культуре.Она является фотодиректором журнала Riposte Magazine , редактором Creative Review и The September Issues, а также пишет для таких изданий и платформ, как It’s Nice That, BJP, The Guardian, Riposte, Sleek, AnOther, Elephant и Ladybeard. Она также написала эссе для различных фотокниг, в том числе «Цветочные мужчины» Кена Херманна и «Молчание» Флоры Ханитихо.

  • Джоно Тасдер — старший фотоагент в Canvas представляет

Джоно Тасдер — старший фотограф в лондонском агентстве по управлению художниками, CANVAS представляет .До этого Джоно был продюсером-фрилансером и совладельцем фотостудии в Шордиче. Он работает в творческой индустрии 9 лет и работал с клиентами, в том числе; Adidas, Alexander McQueen, British Vogue, Calvin Klein, Dazed, Hermès, Luncheon Magazine, M Le Monde, Sandro, Stella McCartney и Wall Street Journal.

  • Лола Папрока — фотограф и основатель Palm* Studios

Лола Папрока — фотограф, специализирующийся на документальной фотографии.Ее внимание сосредоточено на создании работ с сентиментальными повествованиями, которые являются аутентичными и честными в своем представлении предмета, сохраняя при этом ее личную чистую и непритязательную эстетику. . Она основала и курировала Palm* Studios , издательство фотокниг, которое знакомит фотографов и художников с помощью творческих проектов, онлайн-функций, выставок, мероприятий и презентаций книг.Он был основан в 2015 году. Помимо своей личной практики, она также снимает в составе дуэта фотографов с Пани Полом под псевдонимом Лола и Пани . Эта работа, а также части ее личной практики пересекаются с индустрией моды, где они публиковали истории в таких журналах, как The New York Times, British Vogue и i-D Magazine.

  • Махмуд «Мо» Мфинанга — редактор, писатель и фотограф

Родился и вырос в Детройте, Махмуд «Мо» Мфинанга — мультидисциплинарный художник из Бруклина, который в основном работает редактором, писателем и фотографом.Основанная в 2013 году, Махмуд основал Emmazed, онлайн-платформу, ориентированную на сообщество, которая стала станцией управляемых сообществом проектов, направленных на расширение возможностей художников и поощрение прозрачности в мире современного искусства.

  • Прартна Сингх – фотограф

Работа Пратна Сингх исследует вопросы идентичности и гендера, особенно в том, что они пересекаются с чреватой политикой национализма в современной Индии. Ее образы отражают экономическую и политическую траекторию страны, проводя связи между женской ненадежностью и уязвимостью, с одной стороны, и радикальной силой, с другой.Ее практика показывает, как две стороны неразрывно связаны. Эти нарративы намеренно построены в рамках собственных традиций Индии, балансирующих между хрупкостью и изобилием. После получения степени бакалавра фотографии в Школе дизайна Род-Айленда Прартна жила и работала в Нью-Йорке. В настоящее время она базируется в Бомбее. Ее работы публиковались в журналах TIME, The New York Times, 1843: The Economist, The Wall Street Journal, Wired, FT Weekend, Monocle, Bloomberg News и The Guardian.В коммерческом плане она сотрудничала с Dior, Apple, Nike, Uniqlo, Instagram, One Plus, Linkedin и Airbnb.

Фотоприз Palm* 2022 — Palmstudios

  • О
  • Особенности
  • Приз Palm* Photo
  • Новости и события
  • Стокисты
  • Магазин
  • тележка
2018 / 2019 / 2020 / 2021 / 2022

Фотопремия Palm* 2022 г.

О нас

Судьи 2022

Жюри конкурса Palm* Photo Prize

Рекомендации по подаче заявок 2022 г.

Как подать заявку и призы

Условия 2022

Что можно и чего нельзя делать

Спонсоры и партнеры 2022

Премия Palm* Photo стала возможной
  • Палм* Студии
    • Особенности
    • События
    • Стокисты
    • Магазин
  • Информация
    • Палм* Студии
    • Контакт
    • Доставка и возврат
  • Социальные
    • Инстаграм
    • Фейсбук

Финиковая пальма глазами мира

  1. 1.Финиковая пальма
  2. 2. Человек и финиковая пальма

  • 1. Финиковая пальма (цельная финиковая пальма, определенные части, разные времена года и т. д.) в различных ландшафтах и ​​средах.
  • 2. Плоды финиковой пальмы (спелые финики «руттаб», сушеные финики, незрелые финики…) Приветствуются натюрморты, творческие и коммерческие идеи.
  • 3. Наследие промышленности и ремесел, которые зависят от частей финиковой пальмы, таких как (пальмовые листья, ветви и ветви).
  • 4. Люди и тесная связь с финиковой пальмой.
  • 1- Право на участие в конкурсе имеют все фотографы старше 16 лет со всего мира.
  • 2- Заявки ограничены не более чем 4 изображениями в одном разделе (ДАТА ПАЛЬМЫ — цветные или монохромные).
  • 3- Фотографии должны быть сделаны самим фотографом. Должен быть в высоком разрешении не менее dpi 300 (2600 x 2400) мегапикселей. Фотографии должны быть представлены только в формате JPG. Фотографии, сделанные любыми мобильными телефонами, не принимаются.
  • 4- Участник должен создать учетную запись и загрузить фотографии через веб-сайт www.datepalmphoto.com
  • 5- Комбинированные работы или работы с добавленными элементами, такими как время и дата съемки и подпись фотографа, не принимаются.
  • 6- Фотографии, преобразованные в черно-белые, принимаются или модифицируются программами редактирования при условии, что это не изменит цвета или контрастность фотографии.
  • 7- Фотографии-участники не должны публиковаться до или участвовать в каких-либо других конкурсах, где руководство Премии имеет право отклонить или отозвать приз, если докажет это.
  • 8- Отправляя заявку, участник удостоверяет работу как свою (Псевдонимы не допускаются).Участник разрешает спонсорам бесплатно воспроизводить все или часть представленных материалов для публикации и/или показа в средствах массовой информации, связанных с выставкой.
  • 9- Руководство Премии имеет право отклонить любую участвующую фотографию, которая не соответствует условиям, без каких-либо обязательств по предоставлению каких-либо обоснований.
  • 10- Последний день для участия в конкурсе 15.02.2021.
  • 11- Результаты будут объявлены в течение февраля 2021 года, и победитель будет проинформирован по электронной почте для продолжения административных процедур.
  • 12- Победители будут награждены в марте 2021 года после открытия специальной выставки, на которой будут представлены фотографии победителей.
  • 13- В случае победы участнику необходимо отправить копию действительного паспорта и копию своего резюме с указанием его полного имени, номера телефона, адреса электронной почты и P.O. Коробка. В дополнение к номеру своего банковского счета на английском языке (полное имя + название банка и город отделения + номер A / C + код SWIFT), чтобы иметь возможность отправить денежный гонорар.
  • 14- Условия участия в конкурсе являются окончательными, и подача заявки на участие и завершение онлайн-регистрации для участия в конкурсе считается предварительным согласием с вышеуказанными условиями.
  • 15- Участник разрешает спонсорам бесплатно воспроизводить все или часть представленных материалов для публикации и/или показа в средствах массовой информации, связанных с выставкой. Это может включать в себя публикацию с низким разрешением на веб-сайте.
  • 16- Решение Международного жюри является окончательным и рецензия не принимается или ее решение не может быть обжаловано.
  • 1- Первый победитель: (15000 дирхамов ОАЭ)
  • 2- Второй победитель: (10000 дирхамов ОАЭ)
  • 3- Третий победитель: (5000 дирхамов ОАЭ)
  • + Трофей и Почетная грамота ** Все участники получают электронный Сертификат об участии от Премии.

  • 1- Привлечение искусства фотографии в качестве инструмента для повышения осведомленности общественности о важности финиковой пальмы.
  • 2- Создание площадки для обмена опытом между мировыми фотографами.
  • 3- Демонстрация туристических, экологических и культурных преимуществ финиковой пальмы с помощью фотографии.
  • 4- Поощрение связи между человеком, землей и сельским хозяйством.
  • Онлайн-кампус микроскопии ZEISS | Введение в фотоактивируемую локализационную микроскопию (PALM)

    Введение

    Широкопольная и конфокальная флуоресцентная микроскопия позволяют увеличивать и визуализировать светоизлучающие флуорофоры с разрешением, приближающимся к четверти микрометра, что позволяет изучать динамические процессы и тонкие структурные детали клеточной архитектуры.С помощью этих методов было получено ключевое представление о многочисленных событиях, происходящих в клетках, тканях и целых организмах, включая внутрицитоплазматический транспорт везикул, структуру цитоскелета, механизмы ремоделирования тканей и миграцию раковых клеток в больном организме. Центральным моментом в недавнем резком росте использования флуоресцентной микроскопии в клеточной биологии стала разработка генетически кодируемых флуоресцентных белков, которые действуют как эндогенные метки, позволяющие практически любому белку или пептиду стать флуоресцентным маяком самонаведения для визуализации и анализа.Широкая доступность передовых новых приборов и высокочувствительных детекторных систем позволила получить превосходные изображения с пространственно-временными характеристиками, подходящими для решения широкого круга биологических вопросов.

    Несмотря на свое революционное влияние на биологию, все традиционные формы флуоресцентной микроскопии (включая широкопольную, конфокальную и многофотонную) сталкиваются с ограничением разрешения, обусловленным дифракцией света через линзы и круглые апертуры.Волнообразный характер дифрагированного света предотвращает визуализацию объектов размером менее примерно 200 нанометров в поперечном ( x , y ) и примерно 500 нанометров в осевом ( z ) измерениях как что-либо, кроме размытия. В связи с тем, что большинство субклеточных структур (таких как актиновые волокна, промежуточные филаменты, микротрубочки, рибосомы и транспортные везикулы) имеют характеристики, намного меньшие, чем этот размер, механизм преодоления дифракционного барьера и визуализация ниже ограничения размера, которое определяет, был священным Граалем оптической микроскопии на протяжении веков.

    В последнее десятилетие было введено несколько различных концептуальных стратегий для преодоления дифракционного барьера и обеспечения возможности анализа биологических структур на уровне сверхвысокого разрешения. Одна высокоразвитая стратегия, часто называемая разработкой функции рассеяния точки или сверхразрешением на основе освещения, использует нелинейные оптические подходы для уменьшения размера фокусного пятна. Примерами этого типа визуализации сверхвысокого разрешения являются истощение стимулированного излучения ( STED ), истощение основного состояния ( GSD ) и микроскопия с насыщенным структурированным освещением ( SSIM ).Изменяя диаграмму возбуждающего света посредством контролируемой разработки функции рассеяния точки для получения гораздо меньшего размера фокусного пятна, эти передовые методы позволяют различать мелкие структурные детали в биологических образцах. Разрешения, приближающиеся к 20 и 50 нанометрам в поперечном измерении, были достигнуты с помощью STED и SSIM соответственно.

    Вторая (и все более популярная) стратегия преодоления дифракционного барьера использует фотопереключаемые флуоресцентные зонды для разрешения пространственных различий в плотных популяциях молекул со сверхвысоким разрешением.Этот подход основан на стохастической активации флуоресценции для периодического фотопереключения отдельных фотоактивируемых молекул в яркое состояние, которые затем визуализируются и фотообесцвечиваются. Таким образом, очень близко расположенные молекулы, которые находятся в одном и том же дифракционно-ограниченном объеме (и иначе были бы пространственно неразличимы; см. рис. 1(а)), разделены во времени. Слияние всех положений одной молекулы, полученных в результате повторяющихся циклов фотоактивации с последующей визуализацией и обесцвечиванием, дает окончательное изображение сверхвысокого разрешения (рис. 1(b)).Методы, основанные на этой стратегии, часто называют сверхразрешением на основе зондов и обычно называют микроскопией фотоактивации локализации ( PALM ), микроскопией локализации фотоактивации флуоресценции ( FPALM ) и микроскопией стохастической оптической реконструкции ( STORM ). ). Все три метода основаны на одних и тех же принципах, но изначально были опубликованы с использованием разных фотопереключаемых датчиков. На рисунке 1 представлен пример визуализации сверхвысокого разрешения с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения ( TIRF ).Рисунок 1(а) представляет собой пикселизированное изображение одиночных молекул флуоресцентного белка, прикрепленных к покровному стеклу. Положения отдельных молекул не могут быть точно определены из-за их перекрывающихся функций распределения точек, но центр белковых молекул может быть временно разрешен с высокой точностью (рис. 1 (b)) с использованием PALM или аналогичных методов.

    PALM и FPALM были разработаны с использованием фотоактивируемых или фотоконвертируемых флуоресцентных белков (тандемный димер Eos и фотоактивируемый GFP, PA-GFP) в качестве переключаемых зондов, тогда как STORM первоначально был опубликован с использованием синтетических карбоцианиновых красителей Cy3 и Cy5 для маркировки коротких молекул ДНК.Несмотря на незначительные различия в историческом развитии, возможно и целесообразно проводить эксперименты PALM с синтетическими красителями и эксперименты STORM с флуоресцентными белками. В отличие от ситуации с классической флуоресцентной микроскопией, микроскопия сверхвысокого разрешения на основе зондов позволяет определять биологические структуры с нанометровой точностью, подобно самым сложным методам сверхразрешения, основанным на освещении. Однако применение методов визуализации локализации одиночных молекул также позволяет флуоресцентным зондам, выделяющим субклеточные структуры, индивидуально идентифицироваться при высокой молекулярной плотности, чтобы можно было анализировать их распределение и динамику.Такое высокое разрешение открывает двери ко многим возможностям для решения механистических вопросов, касающихся биологических функций, включая картирование молекулярного механизма, а также стехиометрию и динамику.

    Базовая конфигурация микроскопа для сверхвысокого разрешения одной молекулы с полным внутренним отражением (TIRF) представлена ​​на рис. 2. Фотоактивирующий и считывающий лазеры (405 и 561 нм соответственно) расположены так, что при необходимости их можно закрыть или использовать одновременно.Наиболее универсальная схема соединяет лазеры с микроскопом напрямую без волоконной оптики, чтобы обеспечить максимальную мощность (хотя коммерческие инструменты эффективно соединяют лазер (ы) с помощью оптических волокон). Охлаждаемое устройство с зарядовой связью для умножения электронов ( EMCCD ) и система камер присоединены к заднему порту микроскопа, который должен получать 100 процентов испускаемого света для максимального отношения сигнал/шум. Образец устанавливается в специальный держатель и привинчивается к предметному столику с точностью x y для сбора переходных изображений одиночных молекул.Объектив с высокой числовой апертурой располагается под образцом и работает в режиме TIRF. Использование вспомогательной конденсорной системы светлого поля (не показана), оснащенной дифференциальным интерференционным контрастом ( DIC ), позволяет исследовать образец для поиска подходящих областей образца для визуализации одиночных молекул. Центральное место в аппаратуре занимает высокоскоростная компьютерная система, которая получает и обрабатывает изображения, записанные камерой.

    Как методы сверхвысокого разрешения на основе освещения, такие как STED, так и методы на основе зондов, такие как PALM, теперь позволяют биологам визуализировать структуры и динамические процессы в клетках на молекулярном уровне или близком к нему.Улучшение пространственного разрешения на порядок по сравнению с предыдущей методологией оптической микроскопии указывает на то, что эти новые подходы демонстрируют огромный потенциал для решения бесчисленных биологических вопросов, требующих межточечного разрешения ниже дифракционного предела в 200 нанометров. На сегодняшний день микроскопия сверхвысокого разрешения предоставила подробную информацию о тонкой архитектуре клеточных структур, таких как митохондрии, лизосомы, фокальные адгезии, микротрубочки, актиновые филаменты и покрытые везикулы.Основные понятия в PALM Imaging

    Принцип фотоактивируемой локализационной микроскопии и связанных с ней методов основан на сочетании визуализации отдельных флуорофоров (визуализация одной молекулы) наряду с контролируемой активацией и выборкой разреженных подмножеств этих меток во времени. Визуализация отдельных молекул была первоначально продемонстрирована в 1989 году сначала при криогенных температурах, а затем при комнатной температуре с использованием сканирующей оптической микроскопии ближнего поля. С тех пор методология превратилась в стандартный метод широкопольной микроскопии.Предварительное знание того, что дифракционно-ограниченное изображение молекулы происходит из одного источника, позволяет оценить местоположение (центр) этой молекулы с точностью, намного превышающей точность дифракционного предела. Этот высокий уровень точности масштабируется обратным квадратом числа обнаруженных фотонов, как будет описано ниже.

    В общих чертах, одна флуоресцентная молекула формирует дифракционно-ограниченное изображение, размеры которого в поперечном и осевом направлениях определяются длиной волны возбуждения, показателем преломления среды формирования изображения и угловой апертурой объектива микроскопа:

    Разрешение
    x,y = λ / 2[η • sin(α)](1) Разрешение z = 2λ / [η • sin(α)] 2 (2)

    , где λ — длина волны света (возбуждение при флуоресценции), а объединенный член η • sin(α) известен как числовая апертура объектива ( NA ).Объективы, обычно используемые в микроскопии, имеют числовую апертуру менее 1,5 (хотя новые высокопроизводительные объективы почти приближаются к этому пределу), ограничивая термин α в уравнениях (1) и (2) до менее 70 градусов . Следовательно, теоретический предел разрешения при самой короткой практической длине волны возбуждения (приблизительно 400 нм при использовании объектива с числовой апертурой 1,40) составляет около 150 нм в поперечном измерении и приближается к 400 нм в осевом измерении.С практической точки зрения для визуализации усиленного зеленого флуоресцентного белка ( EGFP ) в живых клетках эти значения составляют приблизительно 200 и 500 нанометров соответственно. Таким образом, структуры, расположенные ближе 200-250 нанометров, не могут быть разрешены в латеральной плоскости с помощью широкопольного или конфокального флуоресцентного микроскопа.

    При исследовании боковой плоскости изображения в поле зрения излучателей одиночных молекул центральная часть каждого дифракционно-ограниченного пятна соответствует вероятному положению молекулы и может быть локализована с высокой нанометрической точностью путем сбора достаточного количества фотонов.Методы определения центра локализации основаны на статистической подгонке кривой измеренного распределения фотонов (по сути, пятна изображения, но также называемого функцией рассеяния точки) функции Гаусса (см. Рисунок 3). Конечной целью этого упражнения является определение центра или среднего значения распределения фотонов (90 203 μ 90 204 = 90 203 x 90 249 0 90 250 90 204 , 90 203 y 90 249 0 90 250 90 204 ) и его неопределенности, стандартной ошибки среднего, 90 203 σ , согласно уравнению:

    (3)

    , где N — количество собранных фотонов, a — размер пикселя отображающего ПЗС-детектора, b — стандартное отклонение фона (которое включает фоновое флуоресцентное излучение в сочетании с шумом детектора), а с i — стандартное отклонение или ширина распределения (в направлении i ).Индекс i относится либо к направлению x , либо к направлению y . Первый член под квадратным корнем в правой части уравнения (3) относится к фотонному шуму, тогда как второй член охватывает эффект конечного размера пикселя детектора. Последний член учитывает влияние фонового шума. Применяя эти простые математические методы, точность локализации примерно 10 нанометров может быть достигнута при распределении фотонов около 1000 фотонов, когда фоновый шум незначителен.Расширение этого понимания привело к множеству умных экспериментов по изучению изолированных структур, которые разделены меньше, чем дифракционный предел, таких как меченые молекулярные моторы и наноразмерные молекулярные «линейки» ДНК. Основным технологическим достижением в области поддержки сверхразрешения на основе зондов является широкая доступность и простота использования систем камер EMCCD (см. рис. 2), которые обладают однофотонной чувствительностью.

    Как описано в уравнении (3) , ключ к высокоточным результатам для молекулярной локализации в изображении одиночной молекулы со сверхвысоким разрешением заключается в минимизации фонового шума и максимальном выходе фотонов из флуоресцентного зонда, задача, которую легче описать, чем выполнить.В лучшем случае, если удастся собрать 10 000 фотонов в отсутствие фона до того, как флуорофор обесцветится или выключится, центр локализации можно будет определить с точностью примерно 1–2 нанометра. Напротив, если собрано всего 400 фотонов, точность локализации падает примерно до 20 нанометров или хуже. Фон в образцах сверхвысокого разрешения возникает из-за естественной или индуцированной трансфекционными реагентами аутофлуоресценции, а также из-за остаточной флуоресценции окружающих зондов, перешедших в темное состояние.Таким образом, для методов визуализации одиночных молекул со сверхвысоким разрешением на основе зондов, таких как PALM, флуоресцентные молекулы должны демонстрировать высокий коэффициент контрастности (или динамический диапазон), который определяется как отношение флуоресценции до и после фотоактивации. Вариабельность коэффициентов контрастности флуоресцентных белков и синтетических флуорофоров обусловлена ​​различиями в их спонтанной фотоконверсии в отсутствие контролируемой активации.

    На рис. 3 показаны этапы локализации одиночных молекул с высокой точностью путем подгонки функции рассеяния точки к функции Гаусса.На рисунке 3(а) функция рассеяния точки широкопольного флуоресцентного микроскопа наложена на каркасное представление массива пикселей с цифровой камеры как на двухмерной (вверху слева), так и на трехмерной диаграмме. Пиксельная функция точечного рассеяния одного флуорофора, полученная с помощью EMCCD, показана в верхнем левом углу рисунка 3(b) и смоделирована трехмерной функцией Гаусса с интенсивностью для каждого пикселя, отображаемой цветом в центре. часть рисунка 3(b). Контурная карта интенсивностей представлена ​​на рисунке 3(c).В тех случаях, когда две контурные карты перекрываются из-за излучения флуорофоров с разделяющим расстоянием короче дифракционного предела, центроид для каждого флуорофора может быть локализован отдельно путем вычитания функции рассеяния точки одного флуорофора из другого (после того, как он входит в темное пространство). состоянии или подвергается фотообесцвечиванию) из-за стратегии временного картирования для создания изображений PALM.

    Большинство структур и органелл, наблюдаемых с помощью флуоресцентной микроскопии в биологических системах, очень плотно заселены флуорофорами, при этом значительно более одной молекулы имеют один и тот же дифракционно-ограниченный объем.В таких случаях локализация отдельных молекул практически невозможна из-за того, что полученные флуоресцентные изображения выглядят как сильно перекрывающиеся распределения размытых пятен, ограниченных дифракцией. Механизм вокруг этого затруднительного положения и центральный элемент концепции, связанной с PALM, заключается в последовательной локализации разреженных подмножеств молекул. Эта концепция была впервые продемонстрирована Эриком Бетцигом и Харальдом Хессом за десять лет до того, как была введена PALM, путем разрешения плотно распределенных люминесцентных центров (имеющих разные спектры) в квантовой яме путем визуализации с точно выделенной длиной волны.В результате, хотя многие центры были ограничены объемом пространственного разрешения, они становились разрешимыми при разделении по другому измерению, длине волны.

    Обобщение эксперимента Бетцига и Гесса для микроскопии заключается в том, что если флуоресцентный отклик ансамбля молекул можно распространить в пространстве более высокого измерения, то можно будет отображать источники по отдельности, локализовать каждый из их центров и затем накапливайте координаты центра для создания изображения сверхвысокого разрешения.Эта концепция успешно применялась в нескольких исследованиях до появления PALM и STORM. С помощью лазерной спектроскопии удалось разделить спектры (и локализацию) перекрывающихся органических флуорофоров, хотя и при криогенных температурах. Впоследствии методология была расширена до локализации одной молекулы посредством последовательного фотообесцвечивания или стохастического привлечения флуоресцентных зондов к стационарному сайту связывания. Кроме того, локализация одной молекулы была продемонстрирована посредством анализа стохастического мерцания квантовых точек.

    Микроскопия сверхвысокого разрешения на основе зондов стала реальностью с открытием фотоактивируемых флуоресцентных меток (как флуоресцентных белков, так и синтетических флуорофоров), которые можно было последовательно включать во времени для получения тысяч разреженных подмножеств. Принцип работы этой методологии заключается в том, чтобы начать с подавляющего большинства флуоресцентных меток в неактивном состоянии и не вносить вклад в флуоресценцию образца. Небольшая часть (менее 1 процента) затем активируется освещением ближним ультрафиолетовым светом (в некоторых случаях полезны другие области спектра), чтобы вызвать химическую модификацию нескольких молекул, которая позволяет им флуоресцировать.Это разреженное подмножество затем визуализируется и локализуется для получения координат с точностью до нанометра (см. рис. 3). Затем зарегистрированные метки удаляются с помощью фотообесцвечивания, так что новое разреженное подмножество может быть переведено в активное состояние и отобрано для сбора нового набора молекулярных координат. Процесс может повторяться много тысяч раз до тех пор, пока внутри изображаемой области не накопится миллионы таких молекулярных координат. Композитное изображение, полученное из всех наборов координат, дает изображение со сверхвысоким разрешением для одной молекулы исследуемой флуоресцентно-меченой структуры.Методы молекулярной локализации

    Описано множество методов молекулярной локализации, которые идентифицируют более одной молекулы на дифракционно-ограниченное фокальное пятно. Как обсуждалось выше, один из первых успешных экспериментов в этой области был выполнен с использованием спектрального бинирования на отдельных плотно распределенных люминесцентных частицах в квантовой яме. Аналогичная методика была применена к молекулам пентацена, внедренным в кристалл пара -терфенила, чтобы обеспечить точность локализации приблизительно 40 и 100 нанометров в поперечном и осевом измерениях соответственно.Другой подход исследовал различное время жизни флуоресценции в карбоцианиновом красителе Cy5 и производном родамина JF9, чтобы локализовать две разные молекулы, флуоресцирующие с одинаковыми длинами волн в одной и той же дифракционно-ограниченной области. Точно так же вариации скорости фотообесцвечивания использовались для последовательного изображения и локализации полей молекул до тех пор, пока все они не были обесцвечены. В этом эксперименте определение центроида инициировали с наиболее фотостабильной молекулы, локализовали эту молекулу и повторяли процесс для локализации до пяти молекул с точностью до 10 нанометров в одном и том же фокальном пятне.

    Сообщалось также о нескольких других подходах к высокоточной локализации одиночных молекул, но ни один из них не был успешно применен к большим ансамблям, таким как фокальная адгезия с высокой флуоресценцией. Напротив, PALM и близкородственные методы (такие как FPALM) расширили эти концепции до локализации тысяч молекул с использованием фотоконвертируемых или фотоактивируемых флуоресцентных белков. Техника STORM была введена на основе явления фотопереключения обычных цианиновых красителей, когда они расположены в непосредственной близости друг от друга (менее 2 нанометров).Эти значительные достижения позволили исследователям многократно включать и выключать молекулы контролируемым образом и, таким образом, поддерживать необходимую низкую плотность обнаруживаемых молекул. Поскольку недавно представленные методы сверхразрешения отдельных молекул PALM, FPALM и STORM продвинули молекулярную локализацию на гораздо большем числе молекул, эти подходы оказали революционное влияние на клеточную биологию и должны привести ко многим другим новым разработкам, основанным на аналогичных принципах.

    Как уже упоминалось, центральным элементом концепции визуализации сверхвысокого разрешения на основе зондов является способность выборочно переключать флуоресцентную молекулу между ярким и темным состоянием (фотопереключение) или между одним спектром флуоресцентного излучения и другим (фотопреобразование).Этот тип перехода является основой для молекулярного переключения, которое подробно описано в концепции, называемой обратимым оптически-флуоресцентным переходом с насыщением/переключением ( RESOLFT ). Концепция RESOLFT включает переключение изомеризации между состояниями цис и транс , а также различные другие оптически бистабильные переходы во флуорофорах. Практически все зарегистрированные методы сверхвысокого разрешения, включая STED и GSD, включают в себя тот или иной тип фотопереключения или фотопреобразования.Например, метод, называемый PALM с независимой регистрацией ( PALMIRA ), использует фотопереключаемые флуоресцентные белки, тогда как многие другие методы, включая прямой STORM ( dSTORM ), микроскопию с обратимым фотообесцвечиванием ( RPM ), истощение в основном состоянии с возвратом отдельных молекул ( GSDIM ) и функцией рассеяния точки двойной спирали ( DH-PSF ) микроскопия использует фотопереключение в темные состояния с использованием одного или нескольких обычных синтетических красителей, как будет обсуждаться ниже.

    На рисунке 4 показано фотопереключение нескольких флуорофоров, содержащих систему ксантеновых колец, при умеренной мощности лазера, чтобы продемонстрировать концепцию истощения основного состояния и возврата одной молекулы. График, представленный на рисунке 4(а), показывает быстрое падение интенсивности флуоресценции для зондов родамина 6G и АТТО 532 в присутствии агента, гасящего триплетное состояние ( бета--меркаптоэтанол) по мере увеличения интенсивности возбуждающего лазера. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции начинает быстро падать при относительно низкой мощности лазера, примерно 2 киловатта на квадратный сантиметр, а затем падает гораздо медленнее (почти достигая плато) в оставшейся части диапазона мощности.На рис. 4(b) показан покадровый след флуоресценции одиночной молекулы от молекул ATTO 532, конъюгированных с козьими вторичными антителами, нацеленными на мышиный анти- альфа -тубулин, в клетках HeLa, выращенных на покровных стеклах. Фиксированные и окрашенные клетки погружали в поливиниловый спирт в присутствии миллимолярных количеств бета -меркаптоэтанола. Обратите внимание, что при более высокой мощности лазера аналогичные синтетические красители (такие как Alexa Fluor 488 и 568) переходят в долгоживущее темное состояние, из которого они стохастически возвращаются, используя только простые солевые растворы без добавления тиола или спирта высокой вязкости.Молекулярная локализация высокой плотности

    Поскольку для сбора больших наборов данных в микроскопии со сверхвысоким разрешением для локализации отдельных молекул требуются длительные временные рамки (особенно по сравнению с традиционной широкопольной и конфокальной визуализацией), основная часть экспериментов PALM проводится на фиксированных препаратах клеток или тканей. Адгезивные клетки тканевой культуры, фиксированные параформальдегидом, вряд ли претерпят какие-либо структурные изменения, поэтому время получения изображения не является критическим фактором и обычно определяется количеством флуоресцентных молекул в образце в сочетании с терпением исследователя.Образцы этой категории создали огромное количество изображений, раскрывающих молекулярную организацию белков внутри субклеточных структур с нанометровым разрешением, включая сети филаментного актина и микротрубочек. Поскольку микротрубочки представляют собой отдельные, хорошо охарактеризованные нити, имеющие диаметр приблизительно 25 нанометров и расположенные на различных расстояниях друг от друга, эти структуры являются отличными кандидатами для тестов на разрешающую способность и упражнений по конфигурации микроскопа. Другими потенциально полезными образцами для проверки являются компоненты фокальной адгезии и белки, встроенные в плазматическую мембрану или митохондрии.

    Уникальная особенность, связанная со всеми методами локализации отдельных молекул, заключается в том, что исследователь может свободно определять набор молекул, которые отображаются в конечном результате. Например, в некоторых случаях отображаются только молекулы, которые локализуются с погрешностью выше 10 нанометров, тогда как в других случаях, опираясь на тот же набор данных, могут быть включены молекулы, которые локализуются с точностью до 20 нанометров или меньше. Эта универсальность является критическим моментом в визуализации одиночных молекул PALM, который отличает высокую молекулярную точность и разрешение, которое можно получить с помощью определенных зондов и препаратов для подготовки образцов.Несмотря на то, что расположение молекул в образце может быть определено с высокой точностью (в лучшем случае до пары нанометров), все же заявленное разрешение отдельных структурных элементов должно соответствовать критерию дискретизации Найквиста, составляющему примерно две точки данных на единицу разрешения. . Следовательно, плотность локализованных молекул становится важным фактором для заявлений о разрешении, как показано на рисунке 5 для традиционной фотографии маленького мальчика.

    Концепция точности локализации, разрешения и молекулярной плотности при локализации отдельных молекул абстрактно проиллюстрирована на рис. 5.Серия изображений маленького мальчика демонстрирует, как изображение сверхвысокого разрешения строится путем нанесения локализованных молекул, изображенных на рисунке 5 в виде точек. В целях иллюстрации размеры точек на панелях (а)-(с) изображены намного больше, чем это было бы необходимо для получения окончательного изображения, представленного на панели (d). Изображение мальчика на рис. 5(а) показывает много локализованных точек, но относительно низкая плотность не позволяет распознать изображение. По мере добавления точек к изображениям на рис. 5(b) и 5(c) мальчик становится более узнаваемым, но для различения (разрешения) мелких черт, связанных с его лицом, требуется более высокая плотность точек данных, как показано на рис. 5(г).Важно отметить, что изображение может быть сгенерировано, которое содержит точно локализованные точки данных с использованием методов локализации одиночной молекулы, но плотность этих точек напрямую влияет на способность разрешать особенности в изображении.

    В PALM и других методах локализации одиночных молекул изображения могут быть воспроизведены с молекулами, локализованными с высочайшей точностью (нанометр или два), путем выборочного исключения точек данных с плохой локализацией, но этот успех достигается за счет молекулярной плотности ( и, следовательно, разрешение) в конечном изображении.Эта ситуация может возникнуть просто из-за типа интересующего образца и целевой молекулы, а не из-за произвольно наложенного ограничения молекулярной точности. Таким образом, низкая молекулярная плотность может возникать из-за того, что молекула-мишень слабо представлена ​​в образце. Например, если взять средний диаметр флуоресцентного белка примерно за 2,5 нанометра и белок встроен в органеллу, ограниченную двумерной плоскостью (такую ​​как мембрана), максимальная плотность молекул флуоресцентного белка будет примерно 20 000 на квадратный микрометр.Кроме того, для достижения такой высокой плотности в этом расчете предполагается, что в этой плоскости расположены только молекулы флуоресцентного белка.

    Хотя могут возникать редкие ситуации, когда молекулярная плотность чрезвычайно высока в биологических образцах, таких как описанная выше уплотненная мембрана, обычно это маловероятная физиологическая ситуация в других частях клетки. Если слияния флуоресцентных белков составляют один процент молекул в мембране органеллы, это приводит к примерно 2000 молекулам на квадратный микрометр или около двух молекул через каждые 40–50 нанометров.Плотность выборки этого уровня меркнет по сравнению с достижимой молекулярной точностью, наблюдаемой с помощью электронной микроскопии, и ограничивает любые заявления о разрешении структурных особенностей. Несмотря на это, эксперимент PALM, в котором наблюдают 2000 молекул на квадратный сантиметр в мембране органеллы, предлагает значительный объем информации, несмотря на ограничения разрешения. По сути, изображения с такой плотностью могут показать относительное молекулярное распределение в образце, что часто является целью эксперимента по визуализации.Зонды для микроскопии одиночных молекул сверхвысокого разрешения

    Несколько известных классов флуорофоров стали лучшими кандидатами для мечения субклеточных мишеней в PALM и родственных методах. К ним относятся слияния генетически кодируемых флуоресцентных белков, синтетические красители, квантовые точки и гибридные системы, которые объединяют генетически кодируемый целевой пептид с отдельным синтетическим компонентом, проникающим через мембрану (например, система FlAsH/ReAsH). Каждый конкретный класс флуоресцентных зондов имеет свои сильные и слабые стороны, однако еще не разработан ни один класс или отдельный флуорофор, который бы сочетал в себе все предпочтительные характеристики идеального зонда для любого применения в микроскопии сверхвысокого разрешения для одиночных молекул.Фундаментальное соображение при разработке зондов сверхвысокого разрешения заключается в том, что они должны быть способны фотоактивироваться, фотопереключаться или фотопреобразовываться светом определенного диапазона длин волн в качестве средства изменения их спектральных свойств для обнаружения выбранных субпопуляций.

    Среди наиболее желательных характеристик одномолекулярных зондов со сверхвысоким разрешением — очень высокие уровни яркости и контрастности, которые необходимы для максимизации количества фотонов, которые могут быть обнаружены на молекулу, прежде чем она фотообесцветится или вернется в темное, нефлуоресцентное состояние.Яркость определяется произведением молярного коэффициента экстинкции ( ε абс ) и квантового выхода флуоресценции ( φ ). Таким образом, лучшие зонды имеют высокие коэффициенты экстинкции и квантовые выходы и обеспечивают превосходный контраст по сравнению с фоном. В целом уровни яркости популярных синтетических красителей, таких как Cy5, ATTO 650 и Alexa Fluor 488, очень высоки из-за коэффициентов экстинкции в среднем 100 000 и квантовых выходов, превышающих 0,90. Точно так же квантовые точки имеют столь же высокие уровни яркости.Напротив, оптические свойства флуоресцентных белков оптического маркера гораздо менее оптимальны с коэффициентами экстинкции в диапазоне от примерно 15 000 до 85 000 и квантовыми выходами между 0,05 и 0,80. Ясно, что существует острая необходимость в генной инженерии более полезных флуоресцентных белков для визуализации сверхвысокого разрешения.

    В дополнение к высоким уровням яркости лучшие зонды для микроскопии сверхвысокого разрешения должны демонстрировать спектральные профили для активных и неактивных частиц, которые достаточно хорошо разделены и термически стабильны, чтобы энергии спонтанного взаимного преобразования были очень низкими по сравнению с контролируемой светом энергией активации.В идеале эти датчики также должны демонстрировать высокую надежность переключения, низкую скорость утомления (по сути, число циклов переключения, которое может выдержать) и кинетику переключения, которую можно легко контролировать. С точки зрения фотообесцвечивания или фотопереключения в темновое состояние лучшими зондами являются те, инактивация которых может быть сбалансирована со скоростью активации, чтобы гарантировать, что только небольшая популяция молекул активируется (чтобы они флуоресцировали) для считывания, и что эти активированные молекулы разделены расстоянием, превышающим пределы разрешения системы камер.Кроме того, каждая фотоактивированная молекула должна излучать достаточное количество фотонов в активированном состоянии, чтобы точно определить координаты своего бокового положения.

    Помимо демонстрации необходимого флуоресцентного излучения и других фотофизических свойств, зонды сверхвысокого разрешения PALM также должны быть способны с высокой точностью локализовать намеченные цели и демонстрировать минимально возможный уровень фонового шума. Флуоресцентные белки, гибридные системы и высокоспецифичные синтетические флуорофоры (такие как MitoTrackers) способны избирательно нацеливаться на сборки белков или органеллы, но большая часть состава синтетических красителей и квантовых точек должна быть сначала конъюгирована с молекулой-носителем для точной маркировки.Во многих случаях точная близость флуоресцентного зонда к мишени сомнительна, как и количество фактически задействованных единиц флуорофора, особенно когда небольшие молекулы синтетического красителя или квантовые точки конъюгированы с большими антителами. Кроме того, изменения фотофизических свойств (таких как квантовый выход флуоресценции), вызванные колебаниями окружающей среды или межмолекулярными взаимодействиями, могут усложнить анализ данных. Наконец, независимо от того, проводится ли анализ локализации на фиксированных или живых клетках, аутофлуоресценция, возникающая из-за фиксаторов и реагентов для трансфекции, часто может давать чрезмерно высокий фоновый сигнал, что снижает точность локализации.

    Свойства выбранных флуоресцентных зондов для микроскопии сверхвысокого разрешения

    Белок
    (Акроним)
    Пример
    (нм)
    Em
    (нм)
    EC
    (x 10 -3 )
    квартал N фотонов
    Испущено
    Контраст
    Соотношение
    Четвертичный
    Структура
    Яркость
    (% от EGFP)
    PA-GFP (N) 400 515 20.7 0,13 70 нет данных Мономер 8
    PA-GFP (G) 504 517 17,4 0,79 300 100 Мономер 41
    PS-CFP2 (С) 400 468 43.0 0,20 НД нет данных Мономер 26
    PS-CFP2 (G) 490 511 47,0 0,23 260 1500 Мономер 32
    PA-mCherry1 (R) 564 595 18.0 0,46 НД 4000 Мономер 25
    PA-TagRFP (R) 562 595 66,0 0,38 500 550 Мономер 75
    мКикГР (Г) 505 515 49.0 0,69 НД нет данных Мономер 101
    мКикГР (R) 580 591 28,0 0,63 970 400 Мономер 53
    тдЭос (Г) 506 516 34.0 0,66 НД нет данных Тандем Димер 165
    тдЭос (R) 569 581 33,0 0,60 750 >4000 Тандем Димер 59
    мЭос2 (Г) 506 519 56.0 0,74 НД нет данных Мономер 140
    mEos2 (R) 573 584 46,0 0,66 500 >2000 Мономер 90
    Дендра2 (Г) 490 507 45.0 0,50 НД нет данных Мономер 67
    Дендра2 (R) 553 573 35,0 0,55 НД 300 Мономер 57
    Дронпа 503 517 95.0 0,85 120 Мономер 240
    Дронпа-3 487 514 58,0 0,33 НД НД Мономер 56
    rsFastLime 496 518 39.1 0,77 НД НД Мономер 89
    Падрон 503 522 43,0 0,64 НД НД Мономер 82
    bsDronpa 460 504 45.0 0,50 НД НД Мономер 67
    КФП1 580 600 59,0 0,07 НД НД Тетрамер 12
    mTFP0.7 453 488 60,0 0,50 НД НД Мономер 89
    E2GFP 515 523 29,3 0.91 НД НД Мономер 79
    rsВишня 572 610 80,0 0,02 НД НД Мономер 5
    rsCherryRev 572 608 84.0 0,005 НД НД Мономер 1
    ИрисФП (Г) 488 516 52,2 0,43 НД НД Тетрамер 67
    ИрисФП (правая) 551 580 35.4 0,47 НД НД Тетрамер 50
    Су5 649 664 250,0 0,28 6000 НД нет данных 208
    Cy5.5 675 694 190,0 0,23 6000 НД нет данных 130
    Су7 747 767 200,0 0.28 1000 НД нет данных 167
    Алекса Флуор 647 650 665 240,0 0,33 6000 НД нет данных 236
    АТТО 532 532 553 115.0 0,90 НД НД нет данных 308
    Родамин Б 530 620 105,0 0,65 750 НД нет данных 203
    C-родамин 545 575 90.0 0,90 НД НД нет данных 241
    С-флуоресцеин 494 518 29,0 0,93 НД НД нет данных 80
    Таблица 1

    Подборка свойств наиболее полезных флуоресцентных белков и синтетических красителей для микроскопии сверхвысокого разрешения представлена ​​в таблице 1.Наряду с общим названием и/или аббревиатурой для каждого флуорофора, длинами волн пикового возбуждения ( Ex ) и излучения ( Em ), молярным коэффициентом экстинкции ( EC ), квантовым выходом ( QY ), относительной яркостью, перечислено количество фотонов, испускаемых молекулой ( N фотонов ), и физиологически значимая четвертичная структура. C-родамин и C-флуоресцеин относятся к каркасным производным. Вычисленные значения яркости были получены из произведения молярного коэффициента экстинкции и квантового выхода, деленного на значение для EGFP.Обозначение ND указывает на то, что значения не были определены, тогда как NA означает, что значение не применимо к указанному датчику. Этот список был создан на основе ресурсов научной и коммерческой литературы и не претендует на полноту. Перечисленные значения пиков возбуждения и испускания могут различаться в опубликованных отчетах в некоторых случаях из-за широких спектральных профилей. В реальных исследованиях флуоресцентной микроскопии экспериментальная яркость конкретного флуорофора может отличаться (в относительном выражении) от яркости, указанной в этой таблице.Среди многих потенциальных причин этих различий — зависящие от длины волны изменения коэффициента пропускания или отражения оптики микроскопа и эффективности камеры.

    Присущая подмножеству флуоресцентных белков способность изменять свои спектральные свойства при воздействии света с определенной длиной волны в сочетании с их превосходной специфичностью нацеливания широко использовалась в визуализации со сверхвысоким разрешением (см. зонды, перечисленные в таблице 1). Хотя известно, что флуоресцентные белки подвержены множеству индуцированных светом характеристик фотопереключения, включая генерацию различных излучающих и неиспускающих состояний, а также периодическое мигание, наиболее полезными свойствами являются фотоактивация, фотопреобразование и фотопереключение. свойства, которые можно в совокупности назвать оптической подсветкой (как описано ниже).Фотоактивируемые флуоресцентные белки способны активироваться из темного состояния в яркое флуоресцентное состояние при освещении ультрафиолетовым или фиолетовым светом, тогда как фотоконвертируемые флуоресцентные белки могут оптически трансформироваться из одной полосы излучения флуоресценции в другую. Среди наиболее полезных членов набора фотоактивируемых флуоресцентных белков для визуализации сверхвысокого разрешения можно назвать PA-GFP и PA-mCherry1. фотоконвертируемые флуоресцентные белки, которые нашли применение в PALM и родственных методах, представляют собой тандемный димер Eos (tdEos), mEos2, Dronpa, rsCherry (и обратное производное) и PS-CFP2.

    Члены потенциально наиболее полезного класса флуоресцентных белковых оптических маркеров, способные к фотопереключению между ярко флуоресцентным и темным состояниями, не были особенно полезны в исследованиях сверхвысокого разрешения одиночных молекул из-за низкого выхода фотонов в ярком состоянии. Dronpa использовался в двухцветной визуализации PALM, как будет обсуждаться далее, но он является маргинальным по сравнению с большинством фотоактивируемых и фотоконвертируемых флуоресцентных белков с точки зрения выхода фотонов на молекулу.Однако Dronpa отличается очень высокой контрастностью фотопереключения и флуоресценцией в течение длительного периода времени, что может быть полезно для визуализации живых клеток (например, с использованием отслеживания отдельных частиц, как описано ниже). Помимо требования, чтобы флуоресцентные белки продемонстрировали некоторый тип поведения оптического выделения для изображений сверхвысокого разрешения, они также должны иметь достаточную яркость, скорость созревания хромофора и мономерный характер, чтобы выражать слияние без артефактов, таких как плохое нацеливание и дисфункция.Кроме того, олигомеризация флуоресцентных белков может представлять проблему в стохастической микроскопии сверхвысокого разрешения, поскольку на каждую локализованную молекулу зонда приходится более одного хромофора.

    Быстро растущее число синтетических органических флуорофоров становится отличными кандидатами для визуализации одиночных молекул со сверхвысоким разрешением, включая многие из традиционных зондов, которые использовались в течение нескольких десятилетий при подготовке образцов для широкопольной и конфокальной флуоресцентной микроскопии (см. Таблицу 1).С тех пор было продемонстрировано, что многие соединения, которые первоначально считались фотостабильными, переходят в темное состояние в условиях низкого содержания кислорода в присутствии алифатических тиолов. Следовательно, обратимое фотопереключение, вероятно, является более распространенным явлением, чем первоначально подозревалось, что открывает двери для еще большего числа потенциальных кандидатов-зондов. Кроме того, необратимая фотоактивация может быть достигнута путем «запирания» флуорофоров защитным реактивным фрагментом, который удаляется при облучении ультрафиолетовым светом.Однако, к сожалению, до настоящего времени не было сообщений об органических соединениях или квантовых точках, способных фотопреобразовываться из одного диапазона длин волн излучения в другой.

    На рис. 6 показаны ленточные структуры, молекулярные модели и/или мультипликационные рисунки различных флуоресцентных зондов, которые потенциально могут быть полезны при визуализации одиночных молекул со сверхвысоким разрешением. Синтетический карбоцианиновый краситель Cy5 (рис. 6(а)) значительно меньше, чем желтая квантовая точка (рис. 6(с)) или типичная полипептидная архитектура флуоресцентного белка в форме банки бета (структура зеленой ленты; Рисунок 6(г)).Точно так же все эти зонды имеют уменьшенный размер по сравнению с первичным или вторичным антителом IgG, размер которого может составлять от 12 до 15 нанометров (красная ленточная структура; рис. 6(b)). Квантовые точки должны быть обработаны фрагментами антител, стрептавидином, фаллоидином или каким-либо другим функциональным фрагментом для нацеливания на определенные субклеточные области. Во многих случаях общий размер квантовой точки, конъюгированной с одним или несколькими вторичными антителами, может составлять от 25 до 30 нанометров, что значительно превышает размер мономерного флуоресцентного белка.Наименьшими флуоресцентными зондами являются синтетические красители (рис. 6(а)), но они обладают относительно низкой эффективностью нацеливания и обычно генерируют сильный фоновый сигнал.

    Основным преимуществом использования синтетических флуорофоров и квантовых точек по сравнению с флуоресцентными белками для визуализации сверхвысокого разрешения является их высокая собственная яркость, превосходная фотостабильность, хороший контраст и большая устойчивость к усталости. Например, tdEos дает примерно 750 фотонов на молекулу, в отличие от более чем 6000 фотонов, обычно наблюдаемых для комбинации фотопереключаемых флуорофоров Cy3 и Cy5.Кроме того, карбоцианиновые красители могут подвергаться более 200 циклам переключения перед фотообесцвечиванием. Основным недостатком использования квантовых точек и синтетических флуорофоров является сложность нацеливания на определенные места и высокий фоновый сигнал по сравнению с флуоресцентными белками. Наиболее надежной стратегией нацеливания на флуорофоры этого класса является конъюгация с первичным или вторичным антителом, хотя было показано, что несколько новых синтетических красителей независимо локализуются в специфических органеллах.

    Недостатком использования антител и методов иммунофлуоресценции для маркировки внутриклеточных структур для визуализации сверхвысокого разрешения является то, что белки слишком велики, чтобы проникать через мембраны, и поэтому применимы только в фиксированных и пермеабилизированных клетках, если только мишень не отображается на внешней области плазматической мембраны. Мечение антителами также имеет относительно низкую эффективность и добавляет 10–20 нанометров к неопределенности локализации между меткой и мишенью. Кроме того, конъюгаты квантовых точек с антителами не работают наравне с аналогичными конъюгатами с использованием синтетических красителей, таких как Alexa Fluors и карбоцианины.В перспективе, однако, использование антител для нацеливания на синтетические зонды для PALM и связанных с ними методов обеспечивает гораздо более высокий уровень сигнала, чем флуоресцентные белки, которые более полезны при визуализации живых клеток. К сожалению, поглотители кислорода и тиолы, необходимые для фотопереключения с помощью популярных синтетических красителей, несовместимы с живыми клетками, поэтому, пока не будет разработано обходное решение, флуоресцентные белки будут предпочтительными зондами для микроскопии сверхразрешения живых клеток.

    Квантовые точки представляют собой неорганические полупроводниковые нанокристаллы, состоящие из ядра селенида кадмия (CdSe), окруженного оболочкой из сульфида цинка (ZnS), которые проявляют флуоресцентные свойства благодаря ограниченному излучению экситонов.Для биологических применений на квантовые точки необходимо наносить пассивирующий слой и гидрофильное покрытие, а для нацеливания они также должны быть конъюгированы со стрептавидином или антителами. Профиль испускания флуоресценции квантовых точек удивительно симметричен и обычно демонстрирует большой квантовый выход, в то время как их широкий профиль поглощения позволяет возбуждать их в необычно широком диапазоне длин волн. Размер ядра CdSe определяет спектральный профиль излучения: ядра меньшего размера (примерно до 2 нанометров) излучают в синей и бирюзовой областях, а ядра большего размера (от 5 до 7 нанометров) излучают в желтой и красной длинах волн.

    В целом, фотостабильность квантовых точек значительно превышает фотостабильность всех других известных флуорофоров, включая синтетические флуорофоры и флуоресцентные белки, что создает проблему для стохастической визуализации со сверхвысоким разрешением, если только квантовые точки не могут быть преобразованы в фотопереключаемое состояние. Недавно исследователи продемонстрировали, что легирование квантовых точек ZnSe марганцем может быть использовано для создания частиц, которые могут подвергаться обратимому фотопереключению с высокой эффективностью с использованием света без необходимости использования внешних активаторов или гасителей (эффекторов).Нацеливание остается проблемой для квантовых точек; однако дальнейший прогресс в области химии квантовых точек, несомненно, приведет к созданию новых и лучших зондов в этом классе.

    Среди синтетических зондов с обратимым фотопереключением, которые нашли применение в визуализации сверхвысокого разрешения, есть производные родамина, карбоцианиновые красители (от Cy2 до Cy7), Alexa Fluors и красители ATTO, при этом новые кандидаты разрабатываются и тестируются на постоянной основе. Фотопереключаемые цианиновые красители были наиболее широко используемыми синтетическими органическими зондами в стохастической визуализации со сверхвысоким разрешением.Краситель ближнего инфракрасного диапазона Cy5 наиболее часто используется и может использоваться без эффектора, хотя сочетание Cy5 со вторичным хромофором (таким как Cy3, Cy2 или Alexa Fluor 405) значительно облегчает фотопереключение. В качестве примера применения, объединение Cy5 с Cy3 позволяет использовать красный лазер (635 нм) для фотопереключения Cy5 в стабильное темное состояние, в то время как воздействие света с длиной волны 543 нм преобразует Cy5 обратно во флуоресцентные частицы. Скорость обратного превращения во флуоресцентные виды зависит от близости вторичного эффектора (Cy3).

    Сообщалось о дополнительных комбинациях цианина и красителей Alexa Fluor, таких как Cy3 и Cy5.5 или Cy7 и Alexa Fluor 647 с Cy2 или Cy3, что значительно расширяет доступную цветовую палитру для изображений сверхвысокого разрешения. Кроме того, было продемонстрировано, что большое количество коммерчески доступных синтетических веществ, включая большинство семейств красителей Alexa Fluor и ATTO, обратимо фотопереключаются в фиксированных клетках с использованием протокола, который включает тиолсодержащие восстанавливающие агенты (β-меркаптоэтиламин, дитиотреитол или глутатион). для создания стабильного нефлуоресцентного состояния.Таким образом, потенциал для создания синтетических органических фотопереключателей для многоцветных изображений, хотя механизм переключения еще предстоит определить, в настоящее время превосходит ограниченную палитру FP, которые подвергаются светоиндуцированной модуляции. На рисунке 7 представлены структуры нескольких синтетических зондов, иллюстрирующие большое разнообразие флуорофоров, которые оказались полезными для визуализации сверхвысокого разрешения.

    Подобно фотоактивируемым FP (PA-GFP и PA-mCherry), большая библиотека синтетики в клетке была бы особенно полезна для стохастической визуализации сверхвысокого разрешения.К сожалению, на сегодняшний день сообщалось только о нескольких многообещающих кандидатах: версии флуоресцеина и родамина в клетках, которые, как было продемонстрировано, действуют аналогично PA-GFP при визуализации PALM. На практике синтетика в клетке освобождается от своих защитных сложноэфирных групп с помощью облучения ультрафиолетовым светом для создания флуоресцентных частиц, демонстрирующих превосходный контраст, которые можно локализовать с высокой точностью, а затем подвергать фотообесцвечиванию. До тех пор, пока не появится большее разнообразие флуорофоров в клетке, этот класс будет оставаться ограниченным в приложениях для визуализации со сверхвысоким разрешением.

    Будущее визуализации сверхвысокого разрешения зависит от повышения специфичности и эффективности мечения очень ярких фотопереключаемых флуорофоров при одновременном уменьшении размера пептидов-мишеней. Широкий спектр гибридных систем, предназначенных для соединения синтетических флуорофоров с генетически закодированными мишенями, однажды сможет достичь этой цели. Во всех этих системах используется пептидная или белковая последовательность, которая экспрессируется в живых клетках и способна рекрутировать небольшую синтетическую молекулу для обеспечения флуоресценции.Наиболее разработанный кандидат в этом классе использует мотив тетрацистеина, слитый с различными генетическими мишенями, для привлечения синих, зеленых или красных флуорофоров (CHoAsH, FlAsH и ReAsH соответственно), способных связываться с цистеиновыми остатками для создания зонда, сходного по специфичность для ФП. Основным недостатком этих комбинаций является неспособность преодолеть высокий фоновый уровень несвязанного флуорофора, который снижает контрастность. Был разработан ряд других гибридных систем-кандидатов, но ни одна из них не нашла существенного применения в визуализации со сверхвысоким разрешением.Двухцветная микроскопия сверхвысокого разрешения

    Для выполнения двухцветной визуализации одной молекулы со сверхвысоким разрешением требуется пара флуоресцентных зондов со спектрами излучения, которые хорошо разделены и, в идеальном случае, фотопереключаются или фотоактивируются за счет освещения на разных длинах волн. В настоящее время палитра флуоресцентных белков, потенциально полезных для двухцветной визуализации, ограничена конфликтами спектрального перекрытия излучения, низким выходом фотонов в зондах, имеющих стратегические спектральные профили (красное излучение), и тем фактом, что большинство зондов этого класса активируются свет в том же диапазоне длин волн (ультрафиолетовый или фиолетовый).Существует значительно больше возможностей для соединения двух или более флуорофоров вместе для одновременной или последовательной визуализации в растущем классе синтетических зондов, включая карбоцианины, Alexa Fluors и красители ATTO, которые могут активироваться лазерными линиями с длиной волны от 405 до более чем 647 нм. Поскольку ключом к двух- или трехцветному изображению в PALM и родственных методах является способность идентифицировать и временно разделить излучение каждого активированного зонда, универсальность, обеспечиваемая синтетическими красителями для использования длин волн излучения, возбуждения или активации для различения между зондами. мощный актив.

    Применение флуоресцентных белков для многоцветной визуализации осложняется тем фактом, что большинство доступных в настоящее время зондов с красным излучением имеют флуоресцентное излучение до активации, которое перекрывается с излучением после активации зондов с зеленым излучением. Например, совмещению Dronpa и tdEos мешает тот факт, что зеленый спектральный профиль Dronpa значительно перекрывает предварительно преобразованный профиль tdEos. Однако исследователям удалось отобразить эту пару флуоресцентных белков в двухцветном PALM путем фотоактивации и визуализации tdEos до тех пор, пока все молекулы не будут обнаружены, локализованы и фотообесцвечены, прежде чем деактивировать молекулы Dronpa с использованием интенсивного 488-нанометрового света.Молекулы Dronpa были впоследствии реактивированы, локализованы и объединены с изображениями tdEos для создания окончательного двухцветного изображения. Однако в общей практике истощение одного флуоресцентного зонда перед визуализацией другого не позволяет получить двухцветное изображение одной и той же области в несколько моментов времени и имеет небольшой потенциал для регистрации динамических событий.

    На рис. 8 показана наноструктурная организация актина цитоскелета и белка фокальной адгезии, паксилина, в клетке фибробласта человека (линия HFF-1 ), полученная с помощью двухцветного изображения PALM.Рисунок 8(a) представляет собой составное (двухцветное наложение) изображение актина, слитого с флуоресцентным белком Dronpa (псевдоокрашенный зеленым), и паксилина, слитого с оптическим маркером tdEos (псевдоокрашенный красным), как они проявляются в фокальной адгезии при большом увеличении. . Белая рамка на рисунке 8(a) увеличена на рисунке 8(b), чтобы показать, что между актином и паксилином наблюдается очень небольшое прямое перекрытие (белые стрелки), хотя пучки актина плотно сгруппированы вокруг нескольких фибриллярных паксилиновых спаек (белые стрелки). .В широкопольной визуализации TIRF актин и паксиллин, по-видимому, совместно локализуются в фокальных спайках, в отличие от информации, полученной с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения.

    Превосходный подход для проведения двухцветных экспериментов PALM использует зеленый и красный флуоресцентные белки, которые практически не имеют спектрального перекрытия. Разработка фотоактивируемого красного флуоресцентного производного флуоресцентного белка mCherry с высоким выходом фотонов, PA-mCherry1, позволила получить двухцветную визуализацию с использованием зеленого флуоресцентного производного зеленого флуоресцентного белка PA-GFP.Таким образом, PA-GFP и PA-mCherry1 включаются одновременно с помощью 405-нм лазера, в то время как флуоресценция одиночной молекулы визуализируется с помощью 488-нм и 651-нм лазеров соответственно. Хотя PA-mCherry1 выиграет от дальнейшего улучшения производительности, зонд также потенциально может использоваться с несколькими другими зелеными фотоактивируемыми флуоресцентными белками, такими как Dronpa, rsFastLime и PS-CFP2, для получения аналогичных результатов. По мере разработки новых оптических маркеров с улучшенным выходом фотонов и спектральными свойствами, вероятно, будут значительно улучшены возможности проведения двухцветных экспериментов PALM с флуоресцентными белками как в фиксированных, так и в живых клетках.

    Фотопереключаемые карбоцианиновые красители предлагают широкую палитру зондов для многоцветной визуализации PALM и STORM в сочетании с флуорофорами-активаторами, имеющими различные длины волн активации. Дальнекрасные и ближние инфракрасные красители Cy5, Cy5.5 и Cy7 могут действовать как фотопереключаемые акцепторные репортеры для широкого спектра красителей-активаторов, включая Alexa Fluor 405, Cy2 и Cy3. Смешивание пар активаторов и репортеров в этом классе расширяет количество потенциальных комбинаций, которые можно различить в соответствии с их длинами волн активации или излучения для многоцветной визуализации.Кроме того, карбоцианины с Cy5 по Cy7 также могут спонтанно активироваться и деактивироваться с помощью одного лазера без необходимости в активаторах, при этом все еще создавая легко разделяемые спектры флуоресцентного излучения. Ряд ксантеновых красителей, таких как Alexa Fluors в диапазоне излучения от 500 до 647 нанометров, и некоторые фотохромные родаминовые красители, а также красители ATTO, могут подвергаться фотопереключению с помощью одного и того же лазера, что потенциально позволяет создавать многоцветные изображения. Флуоресцентные белки также можно комбинировать с синтетическими красителями для многоцветной визуализации, как показано для PALMIRA с использованием rsFastLime в паре с Cy5.Трехмерная визуализация PALM

    Первоначально разработанные, PALM и связанные с ними методы сверхразрешения локализации отдельных молекул в основном ограничивались визуализацией в латеральной двумерной плоскости для получения информации о положении отдельных флуорофоров. Зондирование осевого размера было ограничено из-за применения микроскопии полного внутреннего отражения для получения изображения, а также из-за того, что образцы состояли из относительно тонких срезов, полученных с помощью микротома. Обе методологии ограничивают визуализацию в плоскости z глубиной около 100 нанометров, что дает некоторую свободу в отношении осевой визуализации небольших надстроек, но меньше, чем у многих других.Расширенную информацию о вертикальном (осевом) положении можно получить с помощью различных методов в сочетании с фотоактивацией и локализацией. Эти методы можно разделить на несколько различных категорий, включая использование функции рассеяния точки, зависящей от z , исследование образца сбоку и использование интерферометрии в осевом направлении.

    С точки зрения аксиальной ( z ) функции рассеяния точки, простейшим примером является расфокусировка точечного объекта (например, излучателя одиночной молекулы), который расположен выше или ниже идеально сфокусированной плоскости бокового изображения.Изображение такого точечного источника может расширяться, образовывать концентрические кольца вокруг центрального пика или иным образом эволюционировать в форму, отклоняющуюся от нормальной функции рассеяния точки. Основной подход к этому типу визуализации заключается в захвате двух одновременных изображений в двух разных боковых плоскостях, одно из которых недофокусировано, а другое — перефокусировано. Этого можно добиться с помощью светоделителя в сочетании с детекторами, настроенными на отображение двух разных фокусных расстояний. Отношение размеров пятен является монотонной функцией осевого положения и может быть легко вычислено.Известный как метод биплоскости , этот подход позволил достичь в пределах 20-30 процентов стандартного бокового разрешения PALM, чтобы получить функцию рассеяния точки по всей ширине на половине максимума ( FWHM ) приблизительно 75 нанометров с флуоресцентными белками. Основным преимуществом двухплоскостной визуализации является относительная простота доступа к дополнительному измерению.

    Аналогичный подход с перефокусировкой и недофокусировкой может быть реализован вдоль двух ортогональных осей одного изображения, так что ось x может фокусироваться в другом осевом положении, чем ось y .Этот метод был впервые продемонстрирован с помощью STORM путем добавления слабой цилиндрической линзы между объективом и детектором EMCCD. На практике флуоресценция одиночной молекулы дает эллиптическое изображение с соотношением диаметров 90 203 x 90 204 и 90 203 y 90 204, которые показывают относительное осевое положение излучателя. Считывание флуоресцентных эллиптичностей дало примерно 20-нанометровое боковое и 50-60-нанометровое вертикальное разрешение с использованием пар карбоцианиновых красителей (Cy3 и Cy5) в визуализации STORM.Более экзотические функции точечного рассеяния, зависящие от оси, были созданы с помощью модулятора пространственной фазы. Например, двойное точечное изображение может быть сгенерировано из одного точечного источника, где угловая ориентация этого дублета зависит от осевого положения. Таким образом, угловая ориентация может использоваться как считывание осевых координат.

    В качестве альтернативы пространственной фокусировке фемтосекундные импульсы возбуждающего света могут быть сфокусированы во времени, но требуется значительно более сложная конфигурация микроскопа, а метод зависит от нелинейного двухфотонного, а не однофотонного линейного возбуждения.Основное преимущество этого метода заключается в том, что ложное возбуждение уменьшается в областях, удаленных от интересующей области. Таким образом, это сохраняет фотоактивируемую флуоресценцию, позволяя нескольким 1-микрометровым плоскостям формировать стопки изображений PALM толщиной до 10 микрометров. Другая стратегия трехмерного изображения заключается в захвате изображения PALM с ортогонального направления с использованием виртуального изображения бокового обзора, созданного отраженной зеркальной поверхностью. Установка микроскопа включает установку образца в держателе, содержащем зеркала с V-образными канавками, или просто на поверхности зеркала с сильным наклоном.Для калибровки и расчета данных из объединенных данных требуется специальное программное обеспечение.

    Возможно, наилучшее разрешение в трехмерном изображении отдельных молекул достигается при интерферометрии в сочетании с PALM. Этот метод известен как интерференция-PALM ( iPALM ) и продемонстрировал 10-нанометровую точность вертикальной локализации в сочетании с 20-нанометровой точностью латеральной локализации с использованием флуоресцентных белковых меток. Интерферометрия — это распространенный метод измерения положения, основанный на том, как свет интерферирует после того, как он прошел два разных пути, зависящих от положения, прежде чем рекомбинировать с светоделителем.Особые требования когерентности, калибровки и устойчивости к крайне нестабильной флуктуационной природе флуоресценции требуют пристального внимания к деталям конфигурации прибора, которая лучше всего реализуется с противоположными объективами, подобными системе 4Pi . Когерентность можно поддерживать, понимая, что любой испускаемый фотон всегда когерентен относительно самого себя, что является важной концепцией для iPALM. Интерференция, включающая один и тот же фотон, который движется двумя путями с разной длиной пути, зависящей от оси, удовлетворяет этому требованию.Требование самокалибровки также выполняется за счет однофотонной самоинтерференции и может быть устойчивым к флуктуациям флуоресцентного источника за счет использования одновременной многофазной интерферометрии, обеспечиваемой специализированным светоделителем.

    На рисунке 9 представлено сравнение методов трехмерной локализации отдельных молекул для флуоресцентных белков и синтетических красителей в зависимости от количества испускаемых фотонов и осевого и латерального разрешения FWHM. Показана трехмерная точность iPALM и техники расфокусировки в зависимости от количества фотонов, испускаемых золотыми бусинами.iPALM (обозначенный закрашенными кружками и квадратами) демонстрирует лучшую точность локализации на излучаемый фотон, чем методы расфокусировки (закрашенные кружки и квадраты), и обеспечивает лучшее осевое (закрашенные красные кружки) разрешение по сравнению с латеральным (закрашенные синие квадраты). Напротив, методы расфокусировки имеют значительно меньшую точность на излучаемый фотон в осевом направлении (незакрашенные красные кружки) по сравнению с латеральным направлением (незакрашенные синие квадраты). Как правило, большинство методов флуоресцентной микроскопии, в том числе для сверхвысокого разрешения, демонстрируют худшее аксиальное разрешение, чем латеральное, за исключением iPALM.

    Для полной оценки различных трехмерных подходов PALM для конкретного эксперимента необходимо учитывать практические ограничения на параметры образца, включая допустимую толщину, поперечный размер, шкалу времени, плотность маркировки зонда и точность, а также разрешение. Следует иметь в виду, что разрешение — это не просто инструментальное число, а на самом деле критически переплетенное с подходом к маркировке. Например, более яркие метки, которые производят больше фотонов, обеспечивают лучшую точность локализации, но сдерживаются такими соображениями, как длина связи антител, специфичность нацеливания и плотность молекулярной маркировки.Визуализация живых клеток с помощью PALM

    Повторяющийся процесс фотоактивации, визуализации и фотообесцвечивания, связанный с PALM и аналогичными методами локализации отдельных молекул, накладывает значительные временные ограничения на наблюдение за образцами. Чтобы перенести этот метод на визуализацию живых клеток, процесс PALM можно ускорить, увеличив интенсивность как активации, так и возбуждающего света, чтобы ускорить оборот молекул, но живые клетки необходимо тщательно контролировать, чтобы убедиться, что они здоровы.Хотя визуализация живых клеток с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения все еще находится в зачаточном состоянии, несколько исследований служат укреплению фундамента, на котором, вероятно, будут основываться будущие исследования. К ним относятся использование флуоресцентных белков оптического маркера для создания покадровых изображений PALM, для определения среднего распределения или расстояния между молекулами в живых клетках и для создания динамических молекулярных карт. Подобно методам, описанным выше, отображаемая молекулярная плотность в любом отдельном кадре покадрового эксперимента PALM должна оставаться достаточно низкой, чтобы изолировать отдельные молекулы.

    Важно отметить, что в PALM живых клеток плотность локализованных молекул должна быть достаточно высокой, чтобы создать изображение со сверхвысоким разрешением, если целью является измерение движения и перегруппировок структур, обогащенных белком, с субдифракционной точностью. По этой причине подходящими кандидатами являются медленно движущиеся макромолекулярные структуры, такие как комплексы фокальной адгезии, филаментозный актиновый цитоскелет, микротрубочки, промежуточные филаменты или морфологические изменения эндоплазматического ретикулума.На практике примерно от 500 до 1000 молекул на кадр должны быть отображены как можно быстрее с конфигурацией прибора (интервалы сбора данных должны быть ограничены минутой или меньше). Визуализация живых клеток с помощью PALM была проведена на фокальных спайках, чтобы показать, что отдельный комплекс спайки перемещается с различной скоростью, рекрутирует или теряет различное общее количество молекул и претерпевает различные изменения формы. В будущих исследованиях будет рассмотрено множество других сценариев визуализации.

    В уникальной реализации PALM-визуализации живых клеток (см. рис. 10) тысячи отдельных слияний флуоресцентных белков отслеживались с помощью метода, известного как PALM-отслеживание отдельных частиц ( sptPALM ). Траектории флуоресцентных белков использовали для сравнения распределения и динамики двух вирусных белков (ts045 вирусный G-белок везикулярного стоматита, VSVG ; и структурный белок вируса иммунодефицита человека типа 1, Gag), экспрессируемых в плазматической мембране.На рисунке 10 показано молекулярное движение флуоресцентного белка VSVG-tdEos в ячейке COS7 с использованием света с длиной волны 561 нм при одновременной фотоактивации субпопуляций молекул tdEos. Молекулы были локализованы в каждом кадре, и их определенные положения в последовательных кадрах были объединены в треки. Треки на рисунке 10(а) представляют собой молекулы, которые оставались флуоресцентными в течение более 0,75 секунд (показаны разными цветами, чтобы различать отдельные треки). Коэффициент диффузии для каждой дорожки был определен и нанесен на график в виде закрашенного круга в начале дорожки (рис. 10(b)).Каждой дорожке был присвоен цвет в зависимости от ее значения диффузии.

    Результатом визуализации sptPALM на рис. 10 были пространственно разрешенные карты коэффициентов диффузии одиночных молекул, которые выявили совершенно другое поведение диффузии. Было определено, что молекулы VSVG обладают высокой подвижностью, чтобы свободно исследовать плазматическую мембрану, тогда как белки Gag часто обнаруживались в неподвижных кластерах, размер которых приближался к размеру вирусоподобных частиц от 100 до 200 нанометров в диаметре. Аналогичные эксперименты на бактериях с использованием Dendra2 отслеживали гомолог тубулина млекопитающих, Ftx, который образует спиральную нитевидную структуру (называемую кольцом Z ), участвующую в бактериальном цитокинезе.В отличие от видео со сверхвысоким разрешением фокальных спаек, которые фиксируют медленную динамику, отслеживание отдельных молекулярных частиц может выявить гораздо более быструю динамику в ансамблях молекул.

    Выводы

    Микроскопия одиночных молекул сверхвысокого разрешения, несмотря на то, что она все еще является новым методом, привлекает все большее внимание биологов, заинтересованных в понимании клеточных процессов в наномасштабе. В настоящее время доступен ряд методологий, и еще больше разрабатываются, чтобы обойти барьер разрешения, ограниченный дифракцией, налагаемый широкопольной и конфокальной флуоресцентной микроскопией.Методы сверхвысокого разрешения, основанные на освещении, такие как STED, GSD и SSIM, увеличили разрешение до диапазона от 30 до 50 нанометров с использованием обычных флуорофоров, тогда как методы локализации одиночных молекул (PALM и STORM) требуют специальных фотоактивируемых зондов. Обычные зонды успешно использовались для локализации одиночных молекул, полагаясь на переходы молекул между светлым и темным состояниями, но они вполне могут сопровождаться потерей молекулярной плотности во время предэкспериментальных этапов облучения, необходимых для снижения флуоресценции до визуализации одиночных молекул. уровни.

    Основной движущей силой PALM является абсолютная простота как концепции, так и инструментов, требующая только модифицированного широкопольного флуоресцентного микроскопа (для получения изображений одиночных молекул) и способности экспрессировать флуоресцентные слияния в адгезивных клеточных культурах. Тем не менее, будущее PALM и связанных с ним методов локализации одиночных молекул, вероятно, будет связано с более совершенным оборудованием и новыми флуорофорами, которые являются лучшими излучателями фотонов с отличными характеристиками фотопереключения и проявляют флуоресценцию во всем видимом спектре.Кроме того, исследователи должны помнить, что эти методы всерьез начали использоваться менее десяти лет назад и все еще могут считаться находящимися на стадии разработки. Несмотря на это, методы достаточно хорошо разработаны, чтобы коммерческие инструменты теперь были доступны. В будущем усовершенствование фотофизических свойств флуоресцентных зондов в сочетании с усовершенствованием приборов и методов анализа может повысить скорость экспериментов и значительно сократить время сбора данных. Несмотря на эти проблемы роста, быстрый темп развития микроскопии сверхвысокого разрешения дает уверенность в том, что в ближайшие несколько лет изображения ниже дифракционного барьера станут таким же обычным явлением, как сегодня конфокальные изображения.

    Фотоконкурс 2021 | Город Палм-Кост, Флорида

    Эта страница была напечатана с: https://www.palmcoastgov.com/photocontest

    Фотоконкурс

    Фотоконкурс 2021

    Фотоконкурс City of Palm Coast вернулся и продлится до 31 июля 2021 года! Будут вручены призы, а фотографии, представленные на конкурс, будут использованы городскими властями в целях маркетинга, рекламы и связей с общественностью.

    Победившие фотографии покажут, что делает Палм-Кост таким особенным в следующих категориях:

    • Резиденты
    • Исторический
    • Технология
    • Столовая
    • Бизнес
    • Природа

    В каждой категории будет выбрано одно победившее фото, и фотограф получит подарочный сертификат/карту на 100 долларов США в свой любимый бизнес или магазин на Палм-Кост.

    Победившие фотографии будут размещены на веб-сайте города и/или в социальных сетях. Фотографы-победители будут отмечены на заседании городского совета Палм-Коста.

    Фотографы могут представить до 20 работ. Вход бесплатный. Заявки должны быть поданы не позднее полуночи 31 июля 2021 года.

    Вы можете указать границы города Палм-Кост, посетив карту избирательных округов

    По вопросам обращайтесь по адресу [email protected]ком

    *Для участия в конкурсе фотографии должны быть сделаны в городе Палм-Кост. Отправляя свою фотографию, вы даете городу Палм-Кост право использовать фотографию в целях маркетинга, рекламы и связей с общественностью, таких как публикации, видеоролики и веб-сайты, а также на объектах города для продвижения города Палм-Кост. Все представленные материалы станут собственностью города Палм-Кост.


    Благодарим за интерес к нашему фотоконкурсу 2021 года.Мы прекратили прием заявок 31 июля. Следите за обновлениями, чтобы узнать, кто стал нашим победителем!

    Победители фотоконкурса 2016

    фотографий пальм на Flickr | Фликр

    Пальмовые камышевки — перелетные птицы. Они проводят лето на большей части территории Канады, включая Северо-Западные территории и северную часть Соединенных Штатов, где они размножаются, а затем направляются на зиму на юг. Они прибудут сюда уже в сентябре и октябре и останутся до апреля, после чего отправятся в путь на север.

     

    Пальмы можно найти по всей Флориде, вверх по Атлантическому побережью до Каролины и вдоль побережья Мексиканского залива до Техаса. Они также зимуют в Карибском бассейне, включая Кубу, Юкатан и в Центральной Америке. Мы видели их на юге вплоть до Ки-Уэста.

     

    Пальмы ярко окрашены летом, с ржаво-красной шляпкой и ярко-желтым брюшком. Тем не менее, они скучны зимой, когда мы, скорее всего, их увидим. Зимой у них только немного желтого цвета возле хвоста.Если вы внимательно посмотрите на верхнюю фотографию, вы увидите намек на красную шапку ладони.

     

    Их можно спутать с желтопоясничной камышевкой, но желтый цвет на желтом крестце в основном находится на нижней части спины, а желтый на ладони — в основном внизу.

     

    Другие ключевые обозначения включают темную линию, проходящую через глаз, и светлую линию чуть выше. У пальмовых камышевок на спине темные и светлые шевроны, когда крылья сложены. Они напоминают нашивки рядового солдата. Часто, когда вы заметите одну пальмовую славку, рядом будет несколько других.

     

    Два поведенческих признака также помогают идентифицировать пальмовых камышевок: они, как правило, проводят больше времени на земле, чем другие камышевки, и они часто, почти постоянно, встряхивают хвостом. Пальмовые камышевки в основном едят насекомых, но зимой они также едят семена и фрукты. Они часто кормятся на земле.

     

    Существует два типа или подвида пальмовых камышевок: западная и желтая. Оба встречаются во Флориде зимой.

     

    Пальмовые камышевки являются членами семейства Parulidae, семейства камышевок.

     

    Я нашел это на своем заднем дворе в округе Полк, штат Флорида.

    Фото и видео для пальмовой камышевки, All About Birds, Cornell Lab of Ornithology

    Размножающаяся взрослая особь (желтая)

    Большая сторона для камышевки с круглым брюшком и ржавой шапочкой. Камышевки, гнездящиеся к востоку от Гудзонова залива («желтые» пальмовые камышевки), имеют полностью желтую нижнюю часть тела с более сильными ржавыми прожилками на груди и желтыми бровями.

    © Кинан Якола | Библиотека Маколея, штат Мэн, 3 мая 2015 г.
    Гнездящаяся взрослая особь (западная)

    Крупная коренастая славка с ржавой шапочкой.Особи, гнездящиеся к западу от Гудзонова залива («западные» пальмовые камышевки), имеют беловатые брюшки, желтое подхвостье и бледные брови.

    © Брендан Клик | Библиотека Маколея, Мичиган, 18 мая 2019 г.

    Размножающаяся взрослая особь (западная)

    Почти постоянно виляет хвостом. Обратите внимание на желтые кроющие подхвостья, которые характерны для всех оперений и популяций.

    © Джей Макгоуэн | Библиотека Маколея, Нью-Йорк, 1 мая 2015 г. Не все видео со звуком
    Негнездящиеся/неполовозрелые особи (желтые)

    Негнездящиеся/неполовозрелые особи имеют более бледно-желтое подхвостье, тускло-коричневую корону и слабые полосы на груди.Большинство людей в восточной части Северной Америки (желтые) имеют более желтый живот и желтую бровь.

    © Фин Кинд | Библиотека Маколея, штат Мэн, 18 октября 2015 г.
    Негнездящиеся взрослые особи/неполовозрелые особи (Западная)

    Негнездящиеся и неполовозрелые особи имеют более бледно-желтое подхвостье, тускло-коричневую макушку и слабые полосы на груди. У особей западной части Северной Америки (Западной) беловатые животы и бледные брови.

    © Блэр Дудек | Библиотека Маколея, Онтарио, 9 сентября 2020 г.
    Неразмножающиеся взрослые особи/неполовозрелые особи (Западная)

    У неразмножающихся и неполовозрелых особей подхвостье бледно-желтого цвета, тускло-коричневая макушка и слабые полосы на груди.Обратите внимание на желтые кроющие подхвостья.

    © Люк Зейтц | Библиотека Маколея, штат Мэн, 25 сентября 2020 г.
    Неразмножающиеся взрослые особи/неполовозрелые особи (Западная)

    У неразмножающихся и неполовозрелых особей подхвостье бледно-желтого цвета, тускло-коричневая макушка и слабые полосы на груди. Обратите внимание на желтые кроющие подхвостья.

    © Брайан Салливан | Библиотека Маколея, Калифорния, 13 октября 2016 г.

    Гнездящаяся взрослая особь (западная)

    Часто кормится на земле и на открытых площадках. Почти постоянно виляет хвостом.

    © Джей Макгоуэн | Macaulay LibraryНью-Йорк, 06 мая 2015 г. Не все видео со звуком
    Место обитания

    Гнездится в бореальных лесах на болотах с разбросанными вечнозелеными деревьями и густым почвенным покровом. Восточные птицы имеют полностью желтый низ.

    © Даниэль Жовен | Библиотека Маколея, Квебек, 14 июня 2015 г.

    Размножающаяся взрослая особь (западная)

    Летом питается насекомыми, а зимой семенами и ягодами.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.